牵张机械施工技术管理特点的探讨

文章结合张力架线新工艺技术的应用对进口牵张设备及其技术管理的特点进行了探讨,提出了牵张机械使用维护和技术管理的几点建议和注意事项,有助于提高牵张机操作及维护人员的技术管理水平,提高架线工程施工中采用的新工艺技术、新设备机具有的适应能力,保证张力放线机械施工安全,充分发挥牵张设备的效能。

机械牵张通过Piezo1调控骨髓间充质干细胞成骨分化的作用机制

目的探讨机械牵张通过Piezo1促进小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的作用及机制。方法将BMSCs分为0%、3%、6%和12%机械牵张强度组,CCK-8检测细胞增殖,PCR检测成骨因子(Runx2、Osterix、ALP和OPN)mRNA,筛选出最佳牵张强度。再分别设置对照、机械牵张、Piezo1抑制剂、机械牵张+Piezo1抑制剂组。干预结束后,进行ALP染色和ALP活性检测。茜素红染色观察钙结节形成。Western blot检测Piezo1、TGF-β1、p-Smad2和Runx2蛋白水平。结果与0%机械牵张相比,3%和6%机械牵张促进了细胞增殖(P<0.05),且6%机械牵张组Runx2、Osterix、ALP和OPN的mRNA均显著升高(P<0.05)。另外,与对照组相比,机械牵张组ALP染色较深,ALP活性显著升高,钙结节数量增加,Piezo1、TGF-β1、p-Smad2和Runx2蛋白也显著升高(P均<0.05);Piezo1抑制剂组ALP染色较浅,ALP活性显著降低,钙结节数量减少,Piezo1、TGF-β1、p-Smad2和Runx2蛋白也显著降低(P均<0.05)。与机械牵张组相比,机械牵张+Piezo1抑制剂组ALP染色较浅,ALP活性显著降低,钙结节数量减少,Piezo1、TGF-β1、p-Smad2和Runx2蛋白也显著降低(P均<0.05)。与Piezo1抑制剂组相比,机械牵张+Piezo1抑制剂组ALP染色较深,ALP活性显著升高,钙结节数量增加,Piezo1、TGF-β1、p-Smad2和Runx2蛋白也显著升高(P均<0.05)。结论机械牵张可能通过Piezo1上调了TGF-β1/Smad2信号通路表达,促进BMSCs的增殖和成骨分化。

机械牵张对人诱导多能干细胞分化来源的心肌细胞成熟的影响

目的通过使用标准的化学定义和基于小分子诱导方案(chemically defined medium,3 components,CDM3)获得人诱导多能干细胞分化来源的心肌细胞(human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes,hiPSC-CMs),进一步对其施加机械牵张,探讨机械牵张对hiPSC-CMs成熟的影响及潜在机制。方法复苏、培养和鉴定hiPSCs后,将hiPSCs接种到覆有基质胶的传统培养皿上。24 h后在荧光显微镜下通过DAPI荧光观察细胞生长情况,并通过八聚体结合转录因子4(octamer-binding transcription factor 4,OCT4)荧光进行hiPSCs干性鉴定,在细胞汇合度达到80%时更换CDM3分化培养基,分化6 d后将获得的hiPSC-CMs分为对照组和机械牵张组,拉伸结束后重新种板培养24 h后在荧光显微镜下通过DAPI荧光观察细胞生长情况,通过心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)和肌球蛋白轻链2V(myosin light chain 2V,MLC2V)荧光进行hiPSC-CMs心肌细胞标志物鉴定,Piezo1荧光进行潜在机制研究。结果hiPSCs培养24 h免疫荧光显示:OCT4发出绿色荧光,hiPSCs保持干性。DAPI发出蓝色荧光:细胞呈克隆生长,细胞形态均一。机械牵张结束后重新种板培养,24 h后免疫荧光显示机械牵张组较对照组心肌标志物cTnT和MLC2V表达增高(P<0.05);机械牵张组较对照组机械敏感型离子通道Piezo1蛋白表达增高(P<0.05)。结论机械牵张可以促进人诱导多能干细胞分化来源心肌细胞的成熟,这可能与Piezo1蛋白表达增高有关。

体外细胞机械牵张力学装置的研制及力学分布的有限元分析

[目的]建立一种干预体外细胞生长的周期性机械牵拉力学装置。[方法]使用微型电动机控制的支撑物上下位移运动,隆起6孔板具有硅胶弹性的底部基膜,发生周期性形变,使贴附其上的贴壁细胞受牵张应力,并利用三维有限元的方法分析基膜的力学分布,进一步将此装置应用到骨髓间充质干细胞(MSCs)的培养中,对系统进行验证。[结果]此装置操作简单,性能稳定,参数可调性强,生物相容性好,应力变化均匀连续,适当的牵张应力可刺激细胞增殖。[结论]模型可以用于体外应力刺激细胞效应的实验研究。

机械牵张应力刺激成骨细胞的差异蛋白质组学研究

目的应用蛋白质组学方法分析人成骨样细胞Saos-2在牵张应力作用下蛋白质表达的差异,为更全面地阐明成骨细胞对牵张应力的反应机制提供分子基础。方法将Saos-2分为加力组与对照组,采用Flexcell牵张应力加载系统,用12%大小的应力值进行力学刺激24 h后,应用蛋白质双向凝胶电泳分离蛋白样品,质谱技术鉴定差异表达蛋白点,并用生物信息学分析差异蛋白参与的生物学过程和主要功能。结果对照组和加力组分别得到(1031±41)和(928±25)个蛋白质点,质谱鉴定出肽酰脯氨酰异构酶A样3、线粒体ATP合成酶、抗氧化蛋白1、丝切蛋白1、蛋白磷酸酶1、延伸因子2等17个表达增高的差异蛋白质,涉及应激反应、能量代谢、细胞增殖、细胞骨架重建、信号转导及成骨分化等生物学功能。结论成骨细胞在机械牵张应力作用下蛋白表达发生显著变化,这些差异蛋白参与了成骨细胞力学反应机制的不同过程。

TGF-β/Smad信号通路在大鼠间充质干细胞机械牵张中的表达

目的:了解TGF-β/Smad信号通路在大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)加载牵张中的作用。方法:分离培养大鼠骨髓MSCs,应用四点弯曲加力系统对细胞施加单一周期的机械张应力刺激(2000με,60min)。用实时荧光定量RT-PCR与western blot检测TGF-β、Smad4的表达,同时检测MSCs细胞增殖及骨向分化标志物ALP的变化情况。结果:在张应力的作用下,TGF-β,Smad4的表达显著增强(P<0.01)。MSCs的增殖、ALP活性也在加力后增强(P<0.01)。结论:TGF-β/Smad信号通路的激活与细胞受张应力刺激密切相关,并与MSCs增殖与骨向分化趋势一致。表明TGF-β/Smad通路参与了细胞力学信号向生物化学信号的转化。

丙泊酚抑制机械牵张诱导的肺泡上皮细胞HMGB1启动子转录激活

目的探讨丙泊酚对机械牵张诱导肺泡上皮细胞(A549)高迁移率族蛋白B1(high mobility group box1 pro-tein,HMGB1)启动子转录激活的影响。方法以基因重组技术将HMGB1启动子克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic,得到重组质粒pGL3-HMGB1P。采用脂质体介导的细胞转染技术将pGL3-HMGB1P和空载体pGL3-Basic分别转染A549细胞,以机械牵张和机械牵张+丙泊酚分别处理转染后的A549细胞,检测并比较荧光素酶活性,分别用Western blot和RT-PCR检测细胞HMGB1蛋白和mRNA的表达。结果酶切和测序结果证实重组载体pGL3-HMGB1P构建正确,荧光素酶活性检测显示重组载体pGL3-HMGB1P在A549细胞中有效表达。与未牵张组比较,牵张组HMGB1启动子的转录活性和HMGB1表达均明显增加(P<0.05);与牵张组比较,牵张+丙泊酚组HMGB1启动子的转录活性和HMGB1表达均明显降低(P<0.05)。结论丙泊酚在转录水平通过抑制机械牵张诱导HMGB1启动子的转录激活而影响HMGB1的表达,可能是丙泊酚防治机械牵张引起炎症反应的机制之一。

机械牵张作用对牙周膜成纤维细胞增殖的影响

目的 :观察机械牵张作用对牙周膜成纤维细胞 (PDLFs)增殖能力的影响。方法 :用自行研制的细胞加载系统对PDLFs施以频率为 6次 /min(每次为 5s牵拉、5s松弛 ) ,幅度 12 %的牵张力 ,于加载 2 4、48、96h后 ,通过细胞计数、流式细胞仪检测观察PDLFs增殖能力的改变情况。结果 :在不同的时间点 ,加力组及对照组的细胞数均不断增加 ,在 48h及 96h时加力组结果明显高于对照组。流式细胞仪结果显示在不同时间点加力组处于DNA合成期的细胞数明显高于对照组。结论 :在对培养的人PDLFs施加频率为 6次 /min、幅度 12 %的牵张力时 。

NADPH氧化酶参与机械牵张大鼠血管平滑肌细胞MCP-1 mRNA的生成

目的研究周期性机械牵张力对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)产生单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)mRNA的影响以及NADPH氧化酶在此过程中的作用。方法将培养的大鼠VSMCs种植于覆有胶原Ⅰ的BioFlex 6孔培养皿中,分为对照组(C组)、机械牵张组(ST组)和机械牵张+二苯基氯化碘盐预处理组(ST+DPI组),ST组及ST+DPI组采用Flexercell 3000系统给予能使细胞20%的纵向拉伸、频率60次/min的周期性机械牵张力,观察各组细胞MCP-1 mRNA的表达、超氧阴离子的产生以及NADPH氧化酶的胞质亚基P47phox的膜转位表达。结果周期性机械牵张力明显增加VSMCs产生MCP-1 mRNA及超氧阴离子,伴有NADPH氧化酶的亚基P47phox的膜转位表达增加;DPI通过减少P47phox的膜转位表达抑制NADPH氧化酶从而减少超氧阴离子产生,进一步减少MCP-1 mRNA表达。结论机械牵张能活化VSMCs的NADPH氧化酶,通过增加超氧阴离子的形成增加MCP-1 mRNA的生成。

17β-雌二醇对体外机械牵张诱导心肌细胞肥大的影响

目的:研究17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)对体外机械牵张诱导的心肌细胞肥大的影响。方法:以机械牵张刺激体外培养的新生大鼠心肌细胞,建立心肌细胞肥大模型,采用免疫荧光方法分析心肌细胞表面积、Western blot方法检测肥大指标之一β-MHC的表达,以观察E2对机械牵张诱导的心肌细胞肥大的影响,并采用Western blot方法检测心肌细胞整合素β1(inte-grinβ1)表达的变化。结果:与对照组相比,机械牵张24 h后,心肌细胞表面积、心肌细胞胎儿型蛋白β-MHC表达增加,表明机械牵张24 h可诱导心肌细胞肥大。同时,机械牵张24 h心肌细胞整合素β1水平亦显著增加。100 nmol/L E2预处理30 min可明显减轻机械牵张诱导的心肌细胞表面积和β-MHC蛋白水平的增加,降低机械牵张诱导的心肌细胞整合素β1增加,该效应可被雌激素受体非特异性拮抗剂ICI182780逆转。结论:一定水平的E2可改善机械牵张诱导的心肌细胞肥大反应,并且能降低机械牵张诱导的integrinβ1表达的增加。

机械牵张加重模拟缺血缺氧心肌细胞损伤的研究

目的 验证机械牵张加重模拟缺血缺氧对心肌细胞的损伤效应。方法 利用所建立的心肌细胞体外牵张模型 ,模拟施加缺血缺氧因素 ,观察心肌细胞形态、培养液中乳酸脱氢酶 (LDH)含量及碘化丙啶 (PI)染色阳性细胞比例的变化。结果 10 %牵张后 ,心肌细胞形态完整 ,LDH及PI染色阳性细胞比例无明显变化。模拟缺血缺氧后形态明显破坏 ,LDH及PI染色阳性细胞比例显著增加。牵张复合模拟缺血缺氧后 ,细胞形态破坏加剧 ,LDH含量急剧上升 ,PI染色阳性细胞比例进一步显著增加 (P <0 .0 1)。结论 机械牵张加剧了模拟缺血缺氧对心肌细胞的损伤效应 ,提示严重烧伤早期过多过快补液导致心脏前负荷的迅速增加对心肌组织产生牵拉可能会加剧业已存在的心肌细胞损伤 ,从而进一步促进了心肌损害的发生。

机械牵张应变对人牙周膜细胞内游离钙离子浓度的影响

目的:观察机械牵张应变作用下,人牙周膜细胞(HPDLCs)内游离Ca2+浓度的变化。方法:体外培养HPDLCs,利用动态机械应变细胞加载装置,对1%、10%和20%应变组的细胞分别进行30、60和120min的动态牵张加载,通过流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测细胞内游离Ca2+浓度的变化,并应用SPSS13.0软件包对数据进行方差分析。结果:当HPDLCs加载30min时,各组检测到的胞内游离Ca2+浓度与对照组无显著差异(P>0.05);60min时,各个应变组的胞内Ca2+浓度明显升高,与对照组相比均有非常显著的差异(P<0.01);加载时间延长到120min时,各组Ca2+浓度又降至对照组水平(P>0.05)。结论:机械牵张应变可通过钙离子信号系统影响HPDLCs的生物学活性。

大黄素脂质纳米微泡对机械牵张引发的Ⅱ型肺泡上皮细胞MAPK信号通路和炎性介质的影响

目的:研究大黄素脂质纳米微泡对机械牵张引发的Ⅱ型肺泡上皮细胞MAPK信号通路和炎性介质的影响和作用机制。方法:以卵磷脂和PVP为载体材料,采用静电纺丝技术制备纳米纤维膜,填充全氟丙烷,通过自组装技术形成大黄素脂质纳米微泡。分离纯化原代大鼠AT-Ⅱ细胞,应用Western-Blot和ELISA方法观察AT-Ⅱ细胞在20%机械牵张应力的4、8、16、24、48h刺激作用下,p-P38/P38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK蛋白表达和TNF-α、IL-1β、IL-6分泌水平的动态变化;及进一步将大黄素脂质纳米微泡加入AT-Ⅱ细胞对VILI进行干预,并检测干预效果。结果:牵张刺激后,AT-Ⅱ细胞p-P38、p-ERK、p-JNK蛋白表达的水平显著升高,并在4～16h范围内表达水平持续升高,但p38、ERK、JNK蛋白表达无变化;AT-Ⅱ细胞TNF-α、IL-1β、IL-6分泌水平在8h内均无变化,而在随后16h的牵张刺激逐渐显著升高。在VILI刺激下,加入大黄素脂质纳米微泡进行干预,均可以不同程度下调p-P38、p-ERK、p-JNK蛋白表达和抑制TNF-α、IL-1β、IL-6的释放水平。结论:大黄素脂质纳米微泡对机械所致肺损伤(VILI)有保护作用,其机制可能与下调MAPK信号通路蛋白表达来调节炎性介质释放有关。

机械牵张诱导肺泡巨噬细胞的细胞因子表达谱及其与脂多糖对MIP-2释放的协同效应

目的观察机械牵张诱导肺泡巨噬细胞（AM）的细胞因子表达谱，以及机械牵张对脂多糖（LPS）诱导巨噬细胞炎性蛋白2（MIP-2）表达的影响。方法用LiquiChip液相蛋白芯片系统检测机械牵张诱导AM15种细胞因子的水平变化；检测不同强度机械牵张（5％、10％、15％和20％）和牵张刺激（20％）后不同时间点（0、1、3、6、12和24h）AM分泌MIP-2的水平，以及机械牵张（20％）与LPS（10ng／mL）共同刺激对AM分泌MIP-2的影响。结果牵张刺激后AM分泌IL-1β、IL-6、MIP-2、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、IFN-γ和干扰素诱导蛋白10（IP-10）的水平明显升高（P均〈0．001）。机械牵张以强度和时间依赖方式诱导MIP-2的分泌，随着牵张强度的增加（10％、15％和20％），MIP-2的分泌水平也明显增加（P均〈0．001）；在刺激后6～24h范围内MIP-2水平持续升高（P〈0．001）。以机械牵张和LPS共同刺激AM，MIP-2的生成量大大增加，二者存在协同效应（F=121．983，P〈0．001）。结论机械牵张可诱导AM释放多种细胞因子，机械牵张诱导MIP-2的上调具有强度和时间依赖性，并协同LPS诱导AM释放MIP-2，可能在呼吸机所致肺损伤的发生和发展中起重要作用。

p38MAPK在周期性机械牵张诱导肺泡巨噬细胞表达HMGB1中的作用

目的:研究p38 MAPK在周期性机械牵张诱导肺泡巨噬细胞(AM)表达高迁移率族蛋白B1(HMGB1)中的作用。方法:大鼠AM随机分为A、B、C3组,A组为对照组;B组细胞施加20%牵张应变,牵张时间为4h;C组细胞的牵张模式与B组相同,在牵张前用p38 MAPK特异性抑制剂SB203580(40μmol/L)预处理2h。利用RT-PCR法检测HMGB1 mRNA的表达,Western blotting检测HMGB1蛋白表达和p38 MAPK的活性。结果:与对照组相比,AM施加20%牵张应变可诱导HMGB1蛋白和mRNA表达明显增加、p38 MAPK活性明显增高(均P<0.05),SB203580可显著抑制牵张应变的这种诱导作用(均P<0.05)。结论:周期性机械牵张可能通过p38 MAPK信号通路,调节肺泡巨噬细胞HMGB1 mRNA和蛋白的表达。

机械牵张对人成骨样细胞增殖能力的影响

目的 :研究机械张力对成骨细胞增殖能力的影响。方法 :通过Flexercell细胞拉伸力学装置对人成骨样细胞MG 63施加 6%、12 %和 2 4%拉伸应变加载实验 ,用MTT法检测细胞受力后的增殖变化。结果 :细胞受不同大小张力作用后 ,其增殖能力均增强 ,但以 12 %拉伸应变率的促增殖作用最为显著。结论 :机械张力可以促进成骨细胞的增殖能力 。

机械牵张对人气道黏膜上皮细胞黏蛋白5AC表达的影响及其信号通路机制研究

目的观察机械牵张对人气道黏膜上皮细胞黏蛋白(MUC)表达的影响,并对其信号转导机制进行初步探讨。方法采用多功能小型生物撞击机构建体外培养的人气道黏膜上皮细胞牵张模型,分别给予丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的三条主要通路抑制剂:JNK抑制剂(SP600125)、p38蛋白激酶抑制剂(SB203580)及ERK1/2抑制剂(U0126)(浓度均为30μmol/L),并设未进行机械牵张的对照组和单纯机械牵张组。采用流式细胞仪检测牵张前后胞内游离Ca2+荧光强度的变化,激光共聚焦显微镜观察胞内游离Ca2+的分布情况,并分别采用RT-PCR和ELISA方法检测MUC5AC mRNA表达和蛋白分泌量。结果牵张能显著升高人气道黏膜上皮细胞胞内Ca2+浓度、MUC5AC mRNA和蛋白表达(均P<0.01)。U0126和SB203580能抑制牵张所致MUC5AC mRNA和蛋白表达增加(均P<0.01)。结论机械牵张能升高人气道黏膜上皮细胞黏蛋白表达,其机制可能与胞内Ca2+浓度的升高以及ERK1/2、p38 MAPK信号通路有关。

机械牵张对人肺上皮细胞纤维增殖的影响

背景:机械通气是目前重症呼吸疾病重要有效的治疗支持手段之一,但不适当的机械通气可使肺损伤加重,甚至纤维化形成。如何最大程度减少呼吸机相关肺损伤,发挥呼吸机的真正保护作用显得至关重要。肺是一个力学器官,机械通气使肺泡反复充气,对邻近的肺上皮细胞产生牵张作用,使其处于一个非正常的损伤修复过程。因此,过度机械牵张在促进肺纤维增殖发生中可能扮演重要角色。目前国内外关于机械牵张对肺上皮细胞纤维增殖的影响报道较少,其具体发生机制并不清楚。目的:观察不同机械牵张强度及牵张时间对人肺上皮BEAS-2B细胞中转化生长因子β1、波形蛋白及Ⅰ型胶原表达的影响。方法:体外培养人肺上皮细胞株BEAS-2B,取对数生长期的细胞分为静止对照组、10%牵张组、20%牵张组。采用FX-5000T细胞应力加载系统对人肺上皮BEAS-2B细胞以频率20次/min,正弦波形式分别牵张24,48,72 h,采用倒置显微镜观察细胞形态变化,RT-qPCR和免疫荧光方法检测转化生长因子β1、Ⅰ型胶原mRNA表达及波形蛋白表达变化。结果与结论:①静止对照组BEAS-2B细胞呈卵圆形贴壁生长,20%牵张组牵张72 h后细胞形态由鹅卵圆形变为长梭样,细胞间隙增宽;②随着机械牵张强度的增加,BEAS-2B细胞中转化生长因子β1、Ⅰ型胶原mRNA表达及波形蛋白水平较静止对照组均增加,并呈时间依赖趋势(P<0.05);与静止对照组比较,10%牵张组转化生长因子β1、Ⅰ型胶原mRNA及波形蛋白变化不明显;③结果表明,过度机械牵张可刺激人肺上皮BEAS-2B细胞中转化生长因子β1、波形蛋白及Ⅰ型胶原表达增加,过度机械牵张在促进肺纤维增殖发生中发挥重要作用。

p38 MAPK在机械牵张致大鼠心脏TREK-1通道表达改变中的作用

目的:研究p38 MAPK信号途径在急性机械牵张致大鼠离体灌流心脏TREK-1通道表达改变中的作用。方法:30只雄性Wistar大鼠随机分成3组,即对照组、机械牵张组和SB202190(p38 MAPK特异性抑制剂)组,每组10只。利用Langendorff灌流装置等建立离体灌流急性机械牵张的心脏模型;通过Western blotting方法检测各组大鼠左室的p38 MAPK、p-p38 MAPK及TREK-1通道的蛋白表达。结果:各组大鼠左室的p38 MAPK表达无明显差异(P>0.05);机械牵张组左室p-p38 MAPK及TREK-1通道的蛋白表达均明显高于对照组(P<0.01),而SB202190组的p-p38 MAPK及TREK-1蛋白表达与对照组比较无明显差异(P>0.05)且低于机械牵张组。结论:离体灌流心脏受机械刺激时p38 MAPK信号途径的激活可能介导了TREK-1通道的表达上调。心脏可能通过这种方式来改变自身电活动,从而减少心律失常发生,起到自身保护作用。

siRNA抑制高迁移率族蛋白B1对机械牵张诱导肺泡巨噬细胞细胞因子表达谱改变的影响

目的 探讨小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）抑制高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein,HMGB1）基因的表达对机械牵张诱导肺泡巨噬细胞（alveolar macrophage,AM）细胞因子释放的影响.方法 将HMGB1 siRNA真核表达质粒（siHMGB1）在脂质体介导下转染AM,以转染siRNA-A质粒的细胞作为阴性对照.实验分为4组,siHMGB1未牵张组、siHMGB1牵张组、siRNA-A未牵张组和siRNA-A牵张组.将牵张组Bioflex弹性膜细胞培养板置于Flexercell 4000T应力加载系统中,给予细胞施加20%牵张应变,牵张频率为30次/min,牵拉/松弛比为1：1,牵张时间为24 h.采用RT-PCR和Western blot检测HMGB1 mRNA和蛋白表达,应用LiquiChip液相蛋白芯片系统检测细胞培养上清中细胞因子浓度.结果 转染后与siRNA-A转染组比较,siHMGB1转染组细胞HMGB1 mRNA和蛋白表达均显著下降（P〈0.05）;siHMGB1转染细胞可显著抑制机械牵张诱导的IL-1 、IL-6、MIP-2、MCP-1、IFN-γ和IP-10释放（P〈0.05）.结论 应用RNA干扰（RNAi）技术可以有效抑制HMGB1 mRNA和蛋白的表达,进而抑制机械牵张诱导的细胞因子释放,为机械通气所致肺损伤（ventilator-induced lung injury,VILI）的基因治疗提供新思路.