基因组和DNA甲基化组联合分析筛选猪肉质性状关键基因

【背景】猪的肉质性状是重要的经济性状。研究影响各类肉质性状的分子机制,发掘关键基因,从而指导猪的遗传改良,对改善猪肉品质具有重要意义。当前肉质相关的机制研究主要是基于DNA的基因组研究,而对肉质性状的DNA甲基化研究以及结合基因组和甲基化组的综合分析却鲜有报道。【目的】通过基因组和DNA甲基化组联合分析,筛选、鉴定了影响猪肉质的潜在关键基因。为猪肉品质的遗传改良研究提供借鉴。【方法】检测了140头大白猪背最长肌的28个肉质性状,通过表观基因组关联分析(EWAS)与全基因组关联分析(GWAS)筛选了各性状显著关联的CpG和SNP位点。随后以SNP为协变量对GWAS和EWAS重叠的显著关联位点进行条件关联分析,进一步筛选具有独立效应的CpG位点。然后以CpG位点的甲基化水平为因变量,以SNP为自变量进行关联分析从而鉴定甲基化数量性状位点(meQTL)。最后使用顺式甲基化数量性状位点(cis-meQTL)作为工具变量进行孟德尔随机化分析,从而推断cis-meQTL与表型之间的因果关系,同时对位点进行注释,鉴定潜在的关键基因。【结果】(1)在屠宰45 min黄度值(b_(45min))、滴水损失(DL)、二十二碳六烯酸(C22:6n-3)3个肉质性状上,EWAS和GWAS在相同基因组区域鉴定到显著关联位点。(2)b_(45min)的7个CpG位点在条件关联分析后仍保持显著,DL有1个CpG位点在条件关联分析后仍保持显著,而C22:6n-3的3个位点在使用SNP作为协变量分析后不再显著,表明EWAS鉴定的b_(45min)的7个CpG位点和DL的1个CpG位点的显著关联不受附近的显著SNP影响。(3)b_(45min)的7个CpG位点和DL的1个CpG位点共鉴定了10个meQTL,但绝大多数是trans-meQTL,只有一个CpG位点(SSC12:44254675 bp)鉴定到一个cis-meQTL,表明该位点可能受到近距离SNP调控。(4)孟德尔随机化分析显示该CpG位点(SSC12:44254675 bp)与b_(45min)表型存在一定的因果关联。(5)对该位点注释发现,距离CpG位点(SSC12:44254675 bp)和其cis-meQTL最近的基因是NOS2,且CpG位点位于NOS2基因内。【结论】综合DNA甲基化组合基因组数据联合分析结果,可以推测NOS2基因是肉色性状关键候选基因,其DNA甲基化、SNP共同作用调控基因表达,进而影响肉色性状相关基因表达。

位点特异DNA甲基化调控细胞周期素D1基因

DNA甲基化是基因表达调控的重要方式,一般被认为以CpG岛形式发挥作用;近年的研究表明,位点特异的DNA甲基化以元件(cis-regulatory element)的形式在生物微进化以及基因精细调控中发挥重要作用。我们的研究结果显示,曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)导致细胞周期蛋白D1基因表达下调,以及其核心启动子的+65到+77之间的两段串联CpG序列发生DNA甲基化。报告基因结果显示,由细胞周期素D1核心启动子片段驱动的报告基因活性在TSA处理后下降到原来0.12,而前段(A)突变与后段(B)突变时,报告基因活性分别下降到原来1/7.6与1/8.36,双突变则下降到原来1/7.51。对于CMV启动子嵌合15 bp片段驱动的报告基因活性,野生型、A、B与AB双突变型报告基因活性分别下降1/1.48、1/1.17、1/1.51以及1/1.21。体外甲基化研究结果显示,与对照组相比,M.SssⅠ处理组的启动子活性中,野生型活性下降到原来1/8800,A突变型活性下降到原来1/2700,B突变型活性下降到原来1/4156,双突变型活性下降到原来1/6222。应用M.HhaⅠ处理进一步区分甲基化位点,A和B突变型报告基因活性分别下降到原来1/1.11和1/1.40。有趣的是,比对发现劳亚兽总目的+66位点为T。由此,我们联合应用DNA定点突变与体外DNA甲基化模拟技术,研究了细胞周期蛋白D1基因位点DNA甲基化元件的作用。我们的研究表明,细胞周期蛋白D1基因核心启动子的+65位点的甲基化在转录调控过程中可能发挥关键作用,为位点特异甲基化在基因精细调控的机制研究提供实验数据。

核小体定位模式及其与DNA甲基化位点分布的关系

核小体定位是指DNA双螺旋相对于组蛋白八联体的位置.核小体定位通过限制蛋白结合位点参与基因转录调控.本文利用实验检测的人类CD4+T细胞核小体定位数据,研究了核小体定位在转录因子结合位点(TFBS)和转录起始位点(TSS)附近的分布模式,并分析了在TFBS和TSS周围,核小体定位与DNA甲基化之间的关系.结果表明,在休眠和激活的人类CD4+T细胞中,部分TFBS和TSS周围的核小体定位在动态改变,即在定位和缺失两种状态之间切换.在TFBS周围,核小体定位和DNA甲基化存在一种互补模式,核小体定位与DNA低甲基化相联系;而在TSS周围,两者呈现同步模式,DNA高甲基化伴随高核小体水平.而且,在TFBS和TSS周围,DNA甲基化位点的分布呈周期模式.CD4+T细胞被激活时,较少的转录因子启动了较多的基因.

基于多层感知机的DNA甲基化年龄预测模型

衰老的过程中伴随着DNA甲基化的变化,DNA甲基化成为重要的衰老生物标志物之一。近年来,人们对衰老领域的研究越发火热,年龄预测有助于研究生物衰老问题,但预测精度还有待进一步提高。以往的研究大多基于线性回归模型,使用DNA甲基化数据中与年龄高度相关的CpG位点作为特征进行年龄预测。相比机器学习模型,使用深度学习模型对多特征任务包容性更强,能够选取更多的CpG位点作为特征。在Illumina 27K和Illumina 450K阵列的甲基化数据中,选择共同的21368个CpG位点的甲基化数据作为输入,使用多层感知机建立泛组织年龄预测方法MLPAge对年龄进行预测,将MLPAge与泛组织年龄预测方法行业中的标准Horvath 353 CpG时钟进行了比较。在来自8项研究的2310个样本的独立验证集中,其绝对中位数误差(MAD)为3.77年。研究发现,多层感知机能够更好地提取与年龄相关的特征,在年龄预测方面具有更高的准确度,为该领域提供了一种新的基于深度学习的方案。

特异位点DNA甲基化常用检测技术及应用进展

DNA甲基化是表观遗传学的一种重要表现形式。具有相同序列的DNA片段,甲基化修饰会改变其遗传学特征,影响其生物学功能。DNA甲基化与疾病的发生、发展有密切联系。目前,循环肿瘤DNA(ctDNA)检测是众多肿瘤早筛技术中,被采用最多、进展最快的一种检测方法。因此,选择ctDNA甲基化检测方法作为辅助诊断技术,对癌症的早期诊断、预后评估、复发风险预测及临床疗效评价等具有非常重要的意义。本文将阐述特异位点DNA甲基化的常用检测技术及基因位点筛选方法的优缺点,对DNA甲基化的临床应用及国内国家药品监督管理局获证情况进行总结分析,以期对DNA甲基化产品目前存在的技术问题及未来发展趋势进行分析展望,促进DNA甲基化产品的合理应用。

ASPP2基因启动子区DNA甲基化及转录因子DNA结合位点的干湿研究

对p53凋亡刺激蛋白2(ASPP2)基因启动子区进行了甲基化及转录因子结合位点(TFBS)的生物信息学分析及实验研究。结果表明,在该基因近端启动子区存在一个长1391bp的CpG岛,且此区域中包含19个转录因子的37个结合位点,其中有13个转录因子的结合位点含有CpG;甲基化预测发现在含CpG的23个TFBS中有18个位点的CpG易发生甲基化。由此推断ASPP2是典型的多因子调控的CpG岛基因,CpG岛的异常甲基化将影响转录因子结合,导致ASPP2基因表达下调。通过对人肝癌细胞株HepG和人成纤维细胞HFL-1的ASPP2基因启动子CpG岛中含4个E2F结合位点区域的甲基化实验检测,证明这种推断是正确的。这一研究说明,对重要基因启动子区DNA甲基化及TFBS的生物信息学研究可为相关的实验研究提供指南,对促进基因表达的表观遗传调控研究具有重要意义。

利用生物信息工具预测植物中DNA甲基化位点

DNA甲基化是表观遗传学的热点问题。CyMATE(Cytosine Methylation Analysis Tool for Everyone,CyMATE)是一种新的预测DNA甲基化的生物信息工具,能预测重亚硫酸盐基因组测序后得到的序列的甲基化状态。DNA甲基化数据库(DNA methylation database,MethDB)中储存了DNA甲基化的大量信息。用拟南芥(Arabidopsis thaliana)的SUPERMAN(sup)gene(GenBank No.ATU38946)在DNA甲基化数据库中的已知信息检测CyMATE,结果表明CyMATE预测的DNA甲基化水平与DNA甲基化数据库中的原始记录基本一致。此外,从网上搜索一段亚硫酸盐测序后的序列,用CyMATE预测了它的甲基化状态,并对其结果进行了分析。

DNA甲基化差异对猪生长性状的影响

测定和计算了大白×梅山F1 个体180日龄活重、料肉比、日增重、90 kg日龄、相对生长率和(KR)Kleiber5个性状,应用甲基敏感扩增多态技术(MSAP)分析了DNA甲基化与以上生长性状的关系。共扩增出 1 274 个位点,其中在252个多态性位点中,有81个甲基化位点对生产性状产生显著的影响。整体上,亲子代间甲基化差异不显著。但是,经配对数据t检验分析,每对引物在亲子代间扩增的带数表现出一定的差异:梅山猪与F1 代的差异接近显著性标准,大白猪与F1 代的差异达到极显著(P<0 .05)。个体一般甲基化百分差异和个体中性甲基化百分差异对所研究的6个生长性状均无显著的效应(P>0. 05)。除180日龄活重外,个体特殊甲基化百分差异对其余5个性状均产生显著的效应(P<0 .05)。从有利于养猪生产力这一角度讲,5 个生长性状表现都随个体特殊甲基化百分差异的增加而下降。回归分析表明,个体特殊甲基化百分差异与 5 个性状回归关系显著(P<0. 05)。结果显示,DNA甲基化是影响杂种表现或杂种优势的因素之一,可以作为分子标记用于杂种优势的预测和相关的研究;对性状产生显著影响的甲基化位点在预测杂种表现中要优于其它甲基化位点。

HPV-16 E2结合位点甲基化水平与宫颈病变的相关性研究

目的:探讨HPV-16长调控区(LCR)4个E2蛋白结合位点(E2BSs)甲基化水平与宫颈病变的关系。方法:选取单一型HPV-16感染者的宫颈脱落细胞标本59例,分为3组。焦磷酸测序技术定量检测4个E2BSs序列包含的7个Cp G位点的甲基化水平。b DNA技术检测对应标本内E6/E7 mRNA表达水平。分析E2BSs位点甲基化水平与E6/E7 mRNA水平及宫颈病变程度的相关性。结果:HPV-16 E2BSs甲基化水平与宫颈病变均呈正相关(r_s=0.614,0.599,0.289,0.502,P均<0.05),其中E2BS3与宫颈病变间相关性较弱(r_s=0.289,P=0.027)。除E2BS3位点(P=0.070),E2BS 1、2及4位点甲基化水平分别在HPV-16无症状感染组、LSIL组和HSIL+组组间的差异均有统计学意义(P均<0.05)。LSIL组中,4个E2BSs位点间的甲基化水平差异有统计学意义(χ~2=17.672,P=0.001),且E2BS1位点甲基化水平高于E2BS 2、3及4位点甲基化水平(P均<0.05)。HSIL+组内,4个E2BSs位点间的甲基化水平比较,差异有统计学意义(χ~2=18.387,P=0.000),E2BS1位点甲基化水平高于E2BS3和E2BS4位点(P均<0.05),E2BS3位点甲基化水平最低(P均<0.05)。E6/E7 mRNA水平随E2BS1和2位点甲基化水平升高而升高(rs=0.480,0.467,P均<0.05)。E2BS1和E2BS2位点甲基化水平诊断HSIL和SCC病变的ROC曲线下面积(AUC)较大,AUC分别为0.791(95%CI=0.668~0.914)和0.806(95%CI=0.680~0.931),诊断敏感性均为73.9%,特异性分别为72.2%和80.6%。结论:HPV-16E2BSs基因甲基化状态与宫颈病变程度存在相关性,E2BSs甲基化状态有望作为临床上预测宫颈癌前病变及宫颈癌的早期分子指标。

肺栓塞患者差异甲基化位点及区域分析

目的寻找肺栓塞患者差异甲基化CpG位点、甲基化区域及其所对应的目的基因,探讨DNA甲基化在肺栓塞发生中的作用。方法收集2019年1月至2019年12月新疆医科大学附属肿瘤医院确诊的单纯肺栓塞患者和正常对照人群外周血标本各10例,提取DNA,采用Illumina Infinium Methylation EPIC Bead Chip芯片(850K芯片)甲基化检测平台于全基因组水平检测肺栓塞组及正常对照组甲基化位点,利用R包Limma进行两组差异甲基化位点分析,采用Bumphunter的方法寻找两组差异甲基化区域。结果(1)肺栓塞组与正常对照组对比分析,共筛选到95286个有意义的差异CpG位点(P<0.05),其中37983个为高甲基化,57303个为低甲基化;对应28273个目的基因,其中13785个为高甲基化,14488个为低甲基化。显著差异CpG位点在CpG岛的分布情况为:CpG岛29%(27483)、Shore 18%(16700)、Shelf 6%(6011)、Open sea 47%(45092)。(2)采用Bumphunter的方法寻找差异甲基化区域,结果筛选出两组差异甲基化区域DMR-1、DMR-2,分别位于3号染色体(195489708-195490309)和6号染色体(49681178-49681774)上(均P<0.05)。DMR-1宽度601 bp,DMR-2宽度596 bp,DMR-1包含8个CpG位点(cg23170091、cg18918831、cg16034541等),其所属的簇包含8个CpG位点,DMR-2包含11个CpG位点(cg01706515、cg14997592、cg26715042等),其所属的簇包含11个CpG位点,且肺栓塞组DMR-1与DMR-2所有CpG位点甲基化水平均较正常对照组高。DMR-1目的基因为MUC4,DMR-2目的基因为CRISP2。结论DNA的高甲基化可能参与了肺栓塞的发生,差异较大的CpG位点cg06417478、cg18105134及其目的基因HOOK2、PROZ和DMR-1、DMR-2中包含的差异CpG位点及其目的基因MUC4、CRISP2的异常甲基化,或许在肺栓塞的发生中起到重要的作用。

DNA甲基化标记及其在猪生产上的研究进展

表观遗传学是在不影响DNA序列变化的前提下，而发生的可遗传基因表达的变化。DNA甲基化是重要的表观遗传学现象之一，它的主要作用是通过与转录因子相互作用或者改变染色质的结构来抑制基因的表达，启动子区和转录起始位点的DNA的甲基化作用尤其突出，DNA甲基化参与生命体活动的很多过程，目前检测DNA甲基化的方法有亚硫酸氢钠处理为基础的PCR方法、酶切处理为基础的Southern杂交和免疫沉淀法，这些方法总的来说就是整体水平上的基因组甲基化检测、特异性他点的检测以及甲基化新位点的寻找。

单管一步甲基化可变位点分析技术

目的建立单管一步甲基化可变位点(methylation variable position,MVP)分析技术——单管消化后PCR链融解曲线分析(post-digestion PCR-melting curve analysis,PDP-MCA)。方法以文献报道的差异甲基化区(differentially methylated region,DMR)为模型,在MVP两侧设计一组解链温度各不相同的引物。应用FastDigest甲基化敏感性限制酶(methylation-sensitive restriction enzyme,MSRE),在同一反应管内顺次进行DNA的酶切、复合扩增和MCA检测,生成MCA图谱。同时用该方法和传统的MSRE-PCR MCA技术检测相同样品(外周静脉血、精液、阴道液各5份),比较两种方法检测结果,验证其可行性,并分析比较不同样品的MCA/HRM图谱。结果解链温度相差2℃以上的片段,MCA峰分离良好,复合扩增后可以用MCA技术检测。应用单管PDP-MCA技术,可以集酶切、扩增和检测三步于一管,在2h内得到与传统方法一致的特异性图谱和数据,并实现样品的快速分类鉴别。结论单管PDP-MCA技术可以实现多个MVP的单管、闭管检测,具有简便、快速、易于自动化等优点,可用于样品DNA甲基化差异的检测。

糖尿病心脏病患者外周血DNA组甲基化分析:大庆糖尿病预防研究23年随访研究结果

目的:比较中国人群糖尿病和非糖尿病心血管并发症患者的甲基化修饰特点和差异。方法:本研究选取大庆糖尿病预防研究23年随访研究中的40例患者(糖尿病组:10例糖尿病合并心血管病vs 10例糖尿病无心血管病;非糖尿病组:10例血糖正常合并心血管病vs 10例血糖正常无心血管病),行外周血全DNA组甲基化芯片分析。

肝细胞癌相关DNA甲基化诊断生物标志物的筛选及验证

目的筛选肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)相关的甲基化CpG诊断生物标志物。方法下载癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)中HCC的DNA甲基化和表达数据进行生物信息学分析,获得候选CpG位点。采用焦磷酸测序及qRT-PCR检测50例早期HCC组织样本中候选CpG位点的甲基化率及其所在基因的表达量,并验证其诊断效能。在GSE54503、GSE89852和GSE56588数据集中评估候选CpG位点的诊断效能。结果生物信息学分析筛选出5个候选CpG位点(cg12614630、cg19786751、cg06131338、cg23371746和cg25340966),多变量联合诊断的受试者工作特征(receiver operating characteristic curve,ROC)曲线下面积(area under curve,AUC)为0.993。50例早期HCC组织中cg12614630(GPR182)、cg19786751(ACACB)和cg06131338(ACACB)的甲基化率高于癌旁组织以及对应基因的表达水平均低于癌旁组织,且位点甲基化水平与基因表达水平呈负相关(P<0.05)。ROC曲线分析显示,在早期HCC组织以及GSE54503、GSE89852和GSE56588数据集中,3个CpG位点联合诊断的AUC分别为0.903、0.812、0.844和0.934。结论cg12614630、cg19786751和cg06131338 CpG位点可能是HCC潜在的诊断生物标志物,联合检测这3个CpG位点具有良好的诊断效能。

DNA甲基化与肿瘤(综述)

DNA甲基化是哺乳类动物遗传外修饰的重要调控方式,也是脊椎动物DNA惟一的自然化学修饰方式.它在基因突变,基因表达调控,细胞增殖、分化、发育,基因印记等方面起着重要作用,与肿瘤发生和演进有密切联系.大量实验表明,在肿瘤的发生和发展中存在DNA甲基化水平和模式的紊乱,DNA甲基化异常可通过影响染色质结构以及癌基因和抑癌基因的表达而参与肿瘤的形成.因而研究DNA甲基化与肿瘤的关系成为当前分子生物学的热点之一.……

印记基因H19和SNRPN CpG位点甲基化状态与精液参数的关联研究

目的:分析印记基因H19和SNRPN印记控制区的各Cp G位点甲基化状态与男性精液参数的关联。方法:选取2014年4至9月于空军总医院男科就诊的符合纳入排除标准的205例男性为研究对象,采用焦磷酸测序法定量分析H19和SNRPN基因的各Cp G位点的甲基化状态,采用典型相关分析印记基因H19和SNRPN的各Cp G位点的甲基化水平与精液参数两组变量的整体相关性。结果:H19基因的Cp G2和Cp G3甲基化水平与精子密度和精子活动力的相关性具统计学意义;SNRPN基因的Cp G5、Cp G6、Cp G7甲基化水平与精子正常形态率的相关性具统计学意义。结论:印记基因H19和SNRPN印记控制区特定Cp G位点甲基化状态与精液参数有关联。

DNA甲基化差异模式识别方法综述

目前,微阵列芯片技术和重亚硫酸氢盐测序技术贡献了大量DNA甲基化实验数据,基于不同数据产生了众多识别差异甲基化位点及差异甲基化区域的方法。为了对DNA甲基化差异模式识别方法进行梳理,首先介绍了DNA甲基化研究现状,包括DNA甲基化检测方法和数据类型,以及两种DNA甲基化差异模式;接着详细阐述了芯片数据的差异甲基化位点和差异甲基化区域的识别方法,并介绍了基于八种不同算法原理的测序数据的差异甲基化模式识别方法,重点阐述了各种算法的原理、应用场景以及算法的优点和局限性;最后指出了现阶段DNA甲基化差异模式识别存在的问题和未来可能的发展趋势。

p73基因不同启动子区的结合元件和甲基化谱的差异比较

目的 p73基因含有两种不同的启动子结构,转录生成一些具有不同甚至相反的功能特性的异构体。利用生物信息学相关软件比较这两种p73基因启动子区的CpG岛以及潜在的转录因子结合位点的差异。方法利用GenBank获取人p73启动子序列,在线MethPrimer软件分析p73启动子序列中甲基化CpG岛;启动子在线分析软件Promoter2.0,Neural Network Promoter Prediction,Promoter SCAN,TFSEACH分析p73基因启动子区序列中潜在的转录因子结合位点。结果 p73基因有两个启动子结构。promoter1序列中含5个CpG岛,promoter2序列中含1个CpG岛。启动子相关软件分析评分在95分以上时,promoter1序列有11个潜在的转录因子结合位点。promoter2序列有9个潜在的转录因子结合位点。结论 p73基因启动子的甲基化区域以及潜在的转录因子结合位点的差异可能是导致转录产物的功能差异的重要因素。

牛Wif1基因印记及甲基化调控印记的分子机制研究

为了研究Wif1基因在牛中的印记状态和调控印记的分子机制,本研究首先应用基于单核苷酸多态(SNP)的测序方法,分析了Wif1基因在牛组织中的印记状态,结果发现,Wif1基因在牛中的印记表现出组织特异性,在肺中为单等位基因表达,而在心、肝、脾、肾、肌肉和脂肪6个组织中为双等位基因表达。进一步应用亚硫酸氢盐测序法分析Wif1基因启动子区29个CpG位点在牛肺(单等位基因表达)和肝(双等位基因表达)组织中等位基因特异的甲基化状态,结果发现,在肺和肝中,两条亲本链间的甲基化水平无显著差异(P>0.05)。进一步分析每个CpG位点在肺和肝中亲本链间甲基化率差异,发现与双等位基因表达的肝相比,肺中存在8个亲本链间甲基化率差异显著的CpG位点,其中3个(第1、2和6)位于转录因子的结合位点上。由于单个CpG位点的甲基化变化会影响转录因子的结合,推测这3个CpG位点的甲基化可能参与调控Wif1基因的组织特异性印记。