简化基因组测序技术研究进展

随着高通量测序技术的快速发展,简化基因组测序技术作为一种高效标记开发技术得到了广泛应用.现代简化基因组测序技术主要划分成简化代表库、特异性位点扩增片段测序技术以及基于限制性酶切的简化基因组测序技术,针对此3种类型的技术,综述其在群体遗传学、遗传图谱构建及数量性状位点定位等方面的研究进展.

江浙地区菱品种遗传多样性的SLAF-seq分析

利用SLAF-seq技术对江浙地区17个主要的栽培菱品种和1个野生菱种质进行高通量测序,获得445594个SLAF标签,鉴定到多态性SLAF标签95931个。通过序列分析,获得269338个SNP标记,并基于这些SNP构建18份菱样品的遗传发育树及进行群体结构分析。结果表明,SLAF-seq技术能高效地开发出大量可用于群体遗传分析的SNP标记,基于SNP标记构建的进化树能较好地区分不同类型的菱品种。该结果对开展菱种质资源鉴定和菱种质遗传演化研究具有重要参考价值。

细胞质雄性不育辣椒育性恢复基因特异分子标记的筛选

利用集团分离分析法(Bulked segregant analysis BSA),以辣椒细胞质雄性不育系BU-12、恢复系RF-12为材料共筛选了336条RAPD引物,其中引物S418在恢复系中呈现特异性扩增,得到一条约3000bp的特异片段。回扩得到两条片段,测序表明大小为1515bp,1162bp。荧光原位杂交证实1515bp片段为恢复系特有,命名为S418_(1515)。序列分析表明S418_(1515)为一新发现的序列,Blastn序列比对同源性小于40%,tBlastx比对发现该序列与水稻2、4、7、10号染色体的几个BAC克隆上的序列高度同源。推测可能与其具有相似的编码功能,为进一步从分子水平研究辣椒育性恢复打下了坚实的基础。根据测序结果设计特异引物,将S418_(1515)转化成特异PCR标记,证明能用于候选材料的初筛。

AMSS-PCR在肺癌突变基因检测中的价值研究

背景与目的肺癌驱动基因检测具有重要意义,目前检测方法多样,临床适用性有差异。本研究旨在比较基于扩增阻碍突变系统-聚合酶链反应(Amplification Refractory Mutation System-polymerase chain reaction,ARMS-PCR)技术的试剂盒与一代测序及ARMS-qPCR检测肺癌突变基因的敏感性和特异性,探究突变位点特异扩增法(Amplification Mutation Specific System, AMSS)-PCR技术在肺癌突变基因检测中的应用价值。方法对前期已行ARMS-PCR检测的肿瘤标本进行一代测序及试剂盒检测,比较各种方法的检测结果,并对检测结果进行统计学分析。结果本研究共收集了309例肺癌标本。试剂盒与一代测序符合率97.41%,ARMS-PCR的符合率97.73%。试剂盒与一代测序、试剂盒与实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR)、qPCR与一代测序一致性检验的Kappa值分别为0.946、0.953、0.913。试剂盒以一代测序为参照的受试者工作特征曲线(receiver operatingcharacteristiccurve,ROC)曲线下面积为0.976,以qPCR为参照的ROC曲线下面积为0.975。结论 AMSSqPCR技术能够有效检测肺癌突变基因,具有较好的临床应用价值。

人恶性黑色素瘤A375细胞黑素刺激素受体(MC1R)的检测

目的检测人恶性黑色素瘤A375细胞膜上MC1R蛋白及其cDNA,为研究黑色素瘤细胞表面受体及靶向配体奠定基础。方法利用放射配体分析法检测人恶性黑色素瘤A375细胞膜上的MC1R蛋白;用RTPCR方法扩增人恶性黑色素瘤A375细胞MC1R的cDNA,并克隆至pMD18T质粒,进行酶切分析鉴定及扩增片段DNA序列测定。结果放射配体分析结果表明,125IαMSH可与人恶性黑色素瘤A375细胞膜特异结合。RTPCR结果显示,扩增产物的大小与MC1R的cDNA相符。测序结果证实扩增片段为MC1R基因的特异片段。结论证实人恶性黑色素瘤A375细胞膜上表达MC1R蛋白。MC1R基因的成功克隆为其进一步研究提供了必要条件。

HBV DNA PreC／C和BCP片段基因多态性研究

目的：研究乙肝患者HBV DNA核苷酸（nt）1735～1965片段突变及其临床意义。方法：PCR扩增HBV DNA nt1735～1965片段，将产物进行HBV DNA测序。结果：在68例乙肝患者中。nt1735～1965突变阳性率为48．5％，检出点突变总数168个，频率前10位的是nt1764（58．8％）、1762（44．1％）、1799（20．6％）、1766（14．7％）、1896（13．2％）、1754（8．8％）、1899（8．8％）、1768（7．4％）、1814（7．4％）及1913（7．4％）。同时，首次检出nt1907、1922、1923位点突变。

蒿甲醚预防日本血吸虫病诱导的兔特异抗体相关靶抗原编码基因的筛选

目的寻找应用蒿甲醚预防血吸虫后,引起免疫保护作用的抗原分子,为血吸虫病疫苗研究提供新的候选抗原。方法感染血吸虫7天后的家免口服蒿甲醚,收集血清,用蒿甲醚预防后的免疫免血清筛选日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)成虫 cDNA 文库,并对阳性克隆的插入基因片段进行 PCR 扩增及测序分析。结果经三轮筛选,获8个阳性克隆。测序分折所获的这8个序列,其中5个序列分别与日本血吸虫三磷酸甘油醛脱氢酶基因(Sj GAPDH)基因同源,其余3个序列为日本血吸虫28kD 谷胱甘肽-S-转移酶(Sj.GST)基因。结论 Sj.GAPDH 和 Sj.28kDGST 可能是蒿甲醚杀伤血吸虫后,引起对再感染起免疫保护作用的抗原分子。

贵阳花溪古茶树遗传进化的SNP分析

试验采用SNP(单核苷酸多态性)技术对贵阳花溪古茶树资源的遗传多样性、群体结构和遗传进化进行了分析.结果表明,利用生物信息学分析古茶树样品的重测序数据,获得了1656258个SLAF标签,古茶树样品平均测序深度为24.21x,其中多态性的SLAF标签有462897个,共得到283376个高一致性的群体SNP标记.从基于SNP标记获得的进化树可以看出,来自相近地方的古茶树在进化树上基本上处于相近位置,但是花溪古茶树存在着广泛的遗传变异,主成分分析(PCA)获得了与进化树一致的结果.群体结构分析可清晰地把古茶树资源分为乔木型和灌木型2个类群.乔木型古茶树位于进化树下部,而灌木型古茶树处于进化树上部,表明茶树是由乔木型向灌木型进化的.

野生大豆抗胞囊线虫QTL定位

大豆胞囊线虫病(soybean cyst nematode,SCN)是大豆生产上的重要病害,野生大豆是拓宽大豆抗病育种遗传基础的重要种质资源。为发掘野生大豆优异基因资源,利用SLAF-seq技术,以杂交组合"绥农14×ZYD03685"的亲本、126个F2单株及其衍生的F2:3家系为试验材料,进行了SLAF标签的开发、遗传图谱的绘制和QTL分析。共获得7783个SLAF标签用于遗传图谱绘制,遗传图谱总长度为2664.2 cM,20个连锁群的平均长度为133.21 cM。两个SCN抗性QTL(qSCN-1和qSCN-2)分别位于Chromosome 18(Chr 18)的4.25~4.31 Mb和13.50~13.81 Mb,分别解释了22.96%和10.96%的抗性(胞囊指数)变异,QTL区段内分别包含了6个和14个基因。qSCN-2区段未见有前人关于SCN抗性QTL的报道,为新的QTL。本研究为SCN抗性机制解析和利用ZYD03685进行SCN抗病分子育种提供了参考。

HBV DNA PreC/C和BCP片段基因多态性研究

目的 研究乙肝患者HBVDNA核苷酸 (nt) 1735～ 196 5片段突变及其临床意义。方法 PCR扩增HBVDNAnt 1735～ 196 5片段 ,将产物进行HBVDNA测序。结果 在 6 8例乙肝患者中 ,nt 1735～ 196 5突变阳性率为 4 8 5 % ,检出点突变总数 16 8个 ,频率前 10位的是nt 176 4 (5 8.8% )、176 2 (44.1% )、1799(2 0.6 % )、176.6 (14.7% )、1896 (13.2 % )、175.4 (8.8% )、1899(8.8% )、176 8(7.4 % )、1814 (7.4 % )及 1913(7 4 % )。同时 ,首次检出nt 190 7、192 2、192 3位点突变。 5 4例慢性肝炎和 10例肝炎肝硬化患者HBVDNAnt 1896、176 4、176 2位点突变阳性率分别为 16.7%、35.2 %、35.2 %和 30.0 %、6 0.0 %、6 0. 0 % ,两者差异有统计学意义 (P <0.0 1)。结论 该研究提示 :(1)PreC C与BCP区基因突变可能与肝实质纤维化相关 ;(2 )HBVDNA突变发生率较高 ,且位点众多 。

利用SLAF-seq技术构建水稻籼粳交DH群体遗传图谱

我们利用特定位点扩增片段测序技术(specific-length amplified fragment sequencing,SLAF-seq)对籼稻窄叶青8(ZYQ8)和粳稻京系17(JX17)构建的双单倍体(doubled haploid,DH)群体进行了简化基因组测序。将DH群体测序数据与水稻参考基因组进行比较分析,获得了70 997个在两个亲本中存在多态性的SLAF标签。通过进一步的筛选,我们利用8 940个高质量的SLAF标签构建了该群体的遗传图谱。图谱覆盖12个连锁群,总图距为2 294 71 c M,标记间的平均图距为0.26 c M。遗传图谱的连锁群与水稻物理图的相关系数统计显示,除了9号连锁群的相关系数为0.87外,其余的11个连锁群的相关系数均在0.95以上,表明该图谱的12个连锁群与水稻物理图有很好共线性关系。该高密度图谱的构建为我们进一步研究籼、粳差异基因提供了帮助。

牛分支杆菌ESAT-6/Ag85B/Mtb8.4基因与牛IL-2基因融合表达

本研究拟制备牛IL-2与牛分支杆菌ESAT-6、Ag85B和Mtb8.4基因的融合蛋白。从患结核病鹿的肺组织中分离牛分支杆菌并提取基因组DNA,PCR扩增牛分支杆菌ESAT-6、Ag85B和Mtb8.4基因;提取牛淋巴细胞,经总RNA提取、RT-PCR得到了IL-2基因片段。经测序鉴定后,将4个目的片段重组,构建原核表达载体,并对表达的融合蛋白进行鉴定。克隆出了牛IL-2,以及牛分支杆菌ESAT-6、Ag85B和Mtb8.4基因;构建了原核表达载体pME290-SDCZ,并表达出了融合蛋白;Western印迹结果证实该重组蛋白能与抗牛分支杆菌多克隆抗体发生特异免疫结合反应。制备了牛IL-2与牛分支杆菌ESAT-6、Ag85B和Mtb8.4融合蛋白,本研究为下一步研制重组牛结核亚单位疫苗奠定了基础。