噬菌体表面展示技术筛选HCBP6人源单链可变区抗体

目的:制备丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的肝细胞结合蛋白6(HCBP6)的特异性人源化单链可变区抗体(scFv)。方法:采用噬菌体表面展示技术,将生物合成的应用酵母双杂交技术筛选得到的HCV核心蛋白的肝细胞结合蛋白6(HCBP6)16肽固相包被于Nunc板,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“黏附-洗脱-扩增”筛选过程,随机挑选出48个克隆,利用酶联免疫黏附法(ELISA)、交叉反应和竞争抑制实验,对其进行免疫学检测,获得与HCBP6结合活性较强的单链可变区抗体片段的阳性克隆,并对HCBP6特异性scFv的编码序列进行序列测定分析。结果:对噬菌体单链可变区抗体库经过5轮“黏附-洗脱-扩增”的筛选后,结合到包被平皿的噬菌体与第一轮相比,富集了162倍。用酶联免疫黏附法测定第5轮筛选后上清液中含有的噬菌体抗体与HCBP6结合活性。其中有30株克隆ELISA的吸光度(A450 nm)值较高(P8 nm 0.77,P240.714,P26 0.728,P29 0.723,P38 0.803,P39 0.762,P43 0.747等)。对这些噬菌体抗体进行与牛血清白蛋白(BSA)的交叉反应后,确定其中有7株交叉反应较弱(P80.145,P24 0.119,P26 0.17,P29 0.186,P38 0.118,P39 0.138,P43 0.178),结合2次ELISA重复实验的/4值及竞争抑制实验结果,最后确定1株(P24)阳性克隆。提取质粒,SfiI/NotI双酶切后,将片段亚克隆到pCANTABSE载体,进行DNA序列测定,DNA大小为771 bp,符合人源化单链可变区抗体典型的骨架区(FR)及互补决定区(CDR)的序列结构。结论:用噬菌体抗体库技术能够成功地获得HCBP6的scFv。

抗日本血吸虫膜蛋白特异性单链抗体的构建及表达

目的 用基因工程抗体技术构建抗日本血吸虫膜蛋白特异的单链抗体。 方法 用抗体框架区的通用引物 PCR扩增抗日本血吸虫膜蛋白特异性单克隆抗体 NP11- 4的 VH 及 VL 基因 ,测序分析其核苷酸序列。用VH 和 VL 基因在 p THA90质粒载体中构建成单链抗体基因并诱导表达。 结果 扩增获得 NP11- 4的 VH 和 VL基因 ,经测序分析确定为新发现的抗体可变区序列 ,构建成排列顺序为 VH- linker- VL 的单链抗体基因 ,经诱导表达出与硫氧环蛋白融合的单链抗体 ,大小约为 36 .2 k Da,以包涵体形式存在。 结论 成功地构建和表达了抗日本血吸虫膜蛋白特异性单链抗体。

单链抗体在兽医上的应用前景

抗原刺激动物免疫系统产生抗体,抗体识别抗原的部位在其重链和轻链的可变区。抗体是机体防御系统的重要分子,用来识别和清除外来入侵物。为了尽可能的与各种外来物发生作用，免疫系统需要无数种特异性的抗体分子。

传统抗蛇毒血清的改进及新型抗蛇毒抗体的展望

毒蛇咬伤病情急、危害大,需及时治疗,抗蛇毒血清是治疗毒蛇咬伤的唯一特效药。传统的抗蛇毒血清是从动物超免血浆中提取的单蛇毒特异性或多蛇毒特异性免疫球蛋白或免疫球蛋白片段,其外源蛋白的本质属性在临床应用时可引起过敏性反应。新型人源化单克隆抗体技术提供了毒蛇咬伤治疗用人源化和高亲和力抗体的制造手段,是抗蛇毒血清的发展趋势。本文探讨了传统抗蛇毒血清改进优化的方法,以及新型抗蛇毒抗体开发现状及展望,以期为提升抗蛇毒血清质量和升级换代提供参考。

噬菌体抗体库的构建及抗猪脂肪细胞膜单抗的筛选

用猪脂肪细胞以免疫删减法免疫小鼠,取其脾细胞,RT-PCR扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,克隆入噬菌粒表达载体pCANTAB5E中,构建单链抗体(ScFv)文库。用猪脂肪细胞,对其进行3轮吸附-洗脱-富集,筛选抗猪脂肪细胞膜单抗。经ELISA检测,51/96克隆具有与猪脂肪细胞结合活性,阳性率为53%,与猪肝细胞则成阴性反应,初步证明了单抗的特异性,为猪脂肪细胞膜单抗的制备提供了一种新的方法。

抗氨基末端脂多糖结合蛋白基因工程抗体库的构建及体外表达筛选

目的构建人源化的单链可变区抗体库,运用体外表达技术翻译并筛选特异性的抗NHLBP抗体。方法分离健康人外周血单核细胞,抽提总RNA设计引物,扩增抗体轻重链的可变区,通过一段柔性片段将其连接成单链抗体库;应用体外表达技术翻译抗体库,并筛选出与NHLBP高度结合的单链抗体片段。结果扩增的单链抗体可变区片段分别为340bp和325bp,经连接后约为750bp。经过体外表达得到了约27000的抗体片段,经过5轮筛选进化,得到了可与NHLBP高度结合的抗体。结论已成功构建了人源化的单链抗体库;通过体外表达技术筛选到可与NHLBP高度结合的抗体。

抗蓖麻毒素A链人源化单域抗体的设计、原核表达及生物活性检测

目的运用计算机辅助蛋白质分子设计的方法设计针对蓖麻毒素A链（RTA）的拮抗肽，实现在大肠杆菌BL21中的可溶性表达，并对其生物学活性进行评价。方法根据RTA的晶体结构、RTA-rRNA相互作用复合物模型，在CVFF（consistent-valence force field）、Amber力场下，对RTA的空间构象进行理论模拟，初步确定其生物活性功能域；然后针对该功能域设计小分子拮抗肽，并借助人抗体重链可变区骨架，在CDR3区对拈抗肽进行展示，用重叠延伸PCR全基因合成人源化的单域抗体并克隆至载体pET-32a（＋）；双酶切和DNA测序技术对构建的载体进行鉴定；IPTG诱导人源化的单域抗体表达，用镍离子亲和层析纯化，竞争ELISA和MTr法分别进行结合和中和活性检测。结果从头搭建并设计合成了人源化的单域抗体，实现了其原核表达，并进行了生物活性检测；建立了基于人源化的单域抗体的RTA和蓖麻毒素检测方法。结论研究结果为新型蓖麻毒素小分子拈抗剂的研制奠定了理论和实验基础。