高氧、维甲酸对早产鼠肺组织基质金属蛋白酶-2、-9及特异性组织抑制物-1、-2表达的影响

目的探讨基质金属原蛋白-2(MMP-2)、MMP-9、基质金属蛋白酶特异性组织抑制物-1(TIMP-1)和TIMP-2在高氧肺损伤中的作用及维甲酸(RA)的保护作用机制。方法建立高氧(FiO285%)暴露早产SD大鼠肺损伤模型,应用RT-PCR法检测MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2mRNA表达,采用明胶酶谱检测MMP-2和MMP-9酶原及活酶表达,采用Western blot技术检测TIMP-1和TIMP-2蛋白表达。结果与空气组比较,高氧暴露4、7、14d,MMP-2、MMP-9和TIMP-1 mRNA的表达均显著升高(P均<0.01),MMP-2活酶、MMP-9酶原及活酶和TIMP-1蛋白的表达明显上调(P<0.05);RA对空气暴露下它们的表达均无明显影响(P均>0.05),但不同程度下调高氧暴露后MMP-2、MMP-9、TIMP-1mRNA的表达和MMP-2活酶、MMP-9酶原及活酶的表达,进一步提高TIMP-1蛋白表达;高氧、RA对TIMP-2 mRNA和蛋白的表达均无明显影响(P均>0.05)。结论高氧暴露明显改变MMPs/TIMPs的表达,在肺泡形成关键时期,MMPs/TIMPs之间平衡关系的破坏是造成肺发育受阻和纤维化的重要因素;通过协调MMPs/TIMPs之间的表达,改善肺泡结构,降低肺纤维化程度,从而逆转高氧所致肺损伤,是RA发挥保护作用的重要机制之一。

老年乳腺癌组织雌激素受体、孕激素受体与富集AT序列的特异性结合蛋白1及人表皮生长因子受体-2表达的相关性

目的探讨老年乳腺癌组织中雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)与富集AT序列的特异性结合蛋白(SATB)1及人表皮生长因子受体(Cerb B)2表达的相关性。方法回顾性分析原发性乳腺癌患者172例的临床资料。以距肿瘤组织超过5 cm外的癌旁组织为对照,用免疫组化方法检测乳腺癌组织中SATB1、CerbB2表达及其与临床病理特征、ER、PR的关系。结果 SATB1、CerbB2在乳腺癌组织中表达的阳性率显著高于癌旁组织(P<0.05)。组织学分级Ⅲ级的乳腺癌组织中SATB1、CerbB2表达阳性率最高,其次为Ⅱ级、Ⅰ级,差异有统计学意义(P<0.05);临床分期为Ⅲ期的乳腺癌组织中SATB1、CerbB2表达阳性率显著高于Ⅰ+Ⅱ期(P<0.05);有淋巴结转移的乳腺癌组织中SATB1、CerbB2表达阳性率显著高于无淋巴结转移者(P<0.05)。SATB1、CerbB2在乳腺癌组织中的表达与ER、PR表达呈显著负相关(r_(ER)=-0.387,-0.372,r_(PR)=-0.296,-0.329,均P<0.05)。结论 SATB1、CerbB2在老年乳腺癌组织中呈高表达,且与ER及PR表达呈显著负相关。

2型糖尿病患者血清脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂与糖脂代谢的相关性研究

目的探讨2型糖尿病患者血清中脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂(vaspin)与糖脂代谢的关系。方法用ELISA法测定80例2型糖尿病,69例空腹糖耐量受损患者,73例健康对照者血清中vaspin的水平,同时测定空腹血糖(FBG)、总胆固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)、空腹胰岛素(FINS)、糖化血红蛋白(HBA1C)、超敏CRP(hsCRP),并做统计学处理。结果 2型糖尿病组vaspin水平显著高于健康对照组和空腹糖耐量受损组(P<0.05),空腹糖耐量受损组vaspin水平高于健康对照组(P<0.05)。同组患者中肥胖亚组vaspin水平高于非肥胖亚组(P<0.05),2型糖尿病组中血清vaspin与体质指数(body mas index,BMI)、FBG、FINS、HOMA-IR、TG、hsCRP呈正相关(r值分别为0.472、0.464、0.302、0.347、0.268、0.311,P<0.05)。结论 Vaspin是联系2型糖尿病糖脂代谢的重要脂肪因子,与BMI、FBG、FINS、HOMA-IR、TG、hsCRP呈正相关,可为2型糖尿病治疗提供新思路。

基质金属蛋白酶及其组织特异性抑制物与环氧合酶-2在骨性关节炎中的表达及临床生物学意义

目的观察环氧酶-2(COX-2)、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)和组织特异性抑制物-1(TIMP-1)在骨性关节炎(OA)中的表达,探讨其与OA的发生、发展的关系。方法采用苏木精-伊红染色及SABC法,检测OA及正常对照关节软骨组织切片中COX-2、MMP-3和TIMP-1蛋白的表达情况,应用统计学方法对其在OA的发生、发展中与OA病理分级、临床影像学分级的相关性进行非参数分析。并运用Spearman相关分析检验对OA组中MMP-3蛋白与COX-2蛋白的表达进行相关性分析。结果OA中MMP-3、TIMP-1、COX-2蛋白的阳性表达率分别为78.0,68.7和86.7,与它们在正常软骨组织中的比较有显着性差异(P<0.05),MMP-3、COX-2与关节损伤程度成正相关(P<0.05),TIMP-1与关节损伤程度成负相关(<0.05)。结论OA中MMP-3/TIMP-1的变化与COX-2变化无相关性。

血清内皮细胞特异分子-1、 脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂水平对2型糖尿病大血管病变诊断的临床价值

目的探讨血清内皮细胞特异分子-1(Endocan-1)、脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂(Vaspin)水平对2型糖尿病(T2DM)大血管病变(MVC)的临床诊断意义。方法选取72例患者,根据是否合并大血管疾病,分为T2DM组36例和MVC组36例;此外,选同期36例健康者作为对照组。利用酶联免疫吸附检测技术(ELISA)测定3组血清Endocan-1、Vaspin水平。结果T2DM组和MVC组血清Endocan-1水平均高于对照组,且MVC组高于T2DM组,差异有统计学意义(P<0.05)。MCV组Vaspin水平均低于T2DM组和对照组,T2DM组高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。Endocan-1与T2DM合并大血管疾病呈正相关,Vaspin与T2DM合并大血管疾病呈负相关。MVC组血清Endocan-1和Vaspin的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.910%、0.720%,截断值分别为1410 pg/mL、890 pg/mL,敏感度分别为81%、85%,特异度分别为76%、73%。结论血清Endocan-1、Vaspin的水平均与T2DM大血管病变相关,其可作为T2DM大血管病变的诊断依据。

2型糖尿病患者新型脂肪因子血清内脏脂肪素和内脏脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制因子的表达水平与左心室肥厚的关系

目的研究2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者新型脂肪因子血清内脏脂肪素(visfatin)、内脏脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制因子(vaspin)的表达水平与左心室肥厚(left ventricular hypertrophy,LVH)的关系。探讨影响T2DM患者发生LVH的相关因素。方法入选93例明确诊断为T2DM患者,行超声心动图检查评估心脏结构功能,并计算左室心肌质量指数(left ventricular mass index,LVMI)。根据LVMI将患者分为T2DM合并LVH组(病例组,n=45)与T2DM不合并LVH组(对照组,n=48),收集患者一般情况,检测生物化学指标、血清vaspin和visfatin等指标。分析vaspin和visfatin在T2DM中表达情况与LVH的相关性。结果相较于对照组,病例组的visfatin和vaspin浓度升高[(4.57±2.74)ng/mL vs(3.35±2.05)ng/mL,(417.40±230.71)pg/mL vs(328.07±218.99)pg/mL,P<0.05]。Logistic多因素回归分析显示,visfatin、冠状动脉粥样硬化性心脏病、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)是T2DM合并LVH的独立预测因素(P<0.05)。在对visfatin与糖脂代谢相关因素分析中发现,T2DM人群中visfatin浓度与HDL-C呈负相关(P<0.05)。结论在T2DM患者中,随着LVMI的增加,血清visfatin浓度增加。Visfatin可能参与了T2DM发生LVH的病理过程,并与糖脂代谢紊乱相关。Visfatin可能是T2DM患者发生LVH的预测因素。

CDDO-Me对三阴性乳腺癌细胞泛素特异性蛋白酶2a活性及细胞增殖的抑制作用

目的·在三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)细胞中研究筛选得到的泛素特异性蛋白酶2a(ubiquitin-specific protease 2a,USP2a)抑制剂甲基巴多索隆(bardoxolone methyl,CDDO-Me)对USP2a活性及细胞增殖的影响。方法·利用泛素特异性蛋白酶抑制剂筛选系统筛选得到USP2a抑制剂CDDO-Me,采用分子对接分析技术预测CDDO-Me与USP2a的结合情况,采用细胞热迁移实验(cellular thermal shift assay,CETSA)检测CDDO-Me与3种TNBC细胞株内USP2a蛋白的结合情况。通过Western blotting检测USP2a的底物β连环素(β-catenin)和肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)蛋白水平以及凋亡相关蛋白胱天蛋白酶3(caspase3)和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1[poly(ADP-ribose)polymerase1,PARP1]的变化。利用细胞活性检测试剂盒8(cell counting kit-8,CCK8)检测CDDO-Me对TNBC细胞增殖的影响。MDA-MB-468细胞瞬时转染pLVX(pLVX组)或pLVX-USP2a(pLVX-USP2a组)质粒,经CDDO-Me处理后,采用Western blotting检测β-catenin和TRAF6的蛋白水平,流式细胞术检测细胞周期以及台盼蓝拒染法检测活细胞数。结果·CDDO-Me在体外可以抑制USP2a活性,50%抑制浓度为3.84μmol/L。分子对接分析结果显示,CDDO-Me可以和USP2a的His456残基之间形成氢键,和Phe409、Tyr514残基之间具有疏水相互作用。CETSA实验结果显示,CDDO-Me能够和3种TNBC细胞中的USP2a蛋白结合。Western blotting结果显示,CDDO-Me可以下调USP2a底物β-catenin和TRAF6的蛋白水平,而相同浓度的CDDO-Me处理USP2a过表达的MDA-MB-468细胞,发现β-catenin和TRAF6蛋白水平未出现明显降低。CDDO-Me呈剂量依赖性抑制TNBC细胞的增殖,使细胞发生caspase3活化和PARP1的剪切并且导致细胞出现S期和G2/M期阻滞。与pLVX组相比,pLVX-USP2a组活细胞数目更多,细胞也未出现周期阻滞。结论·CDDO-Me可以抑制TNBC细胞中USP2a的活性,并且抑制TNBC细胞的增殖,诱导其凋亡。

糖尿病肾病患者血清脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂水平及其相关因素的研究

目的探讨2型糖尿病患者血清中脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂（Vaspin）的水平及其与糖尿病肾病的关系。方法随机选取50例健康对照者与96例2型糖尿病患者,根据24小时尿蛋白排泄率（UAER）分为DM组（UAER〈20μg/min）,微量白蛋白尿组（DN1组,UAER 20～200μg/min﹞和大量白蛋白尿组（DN2组,UAER〉200μg/min）。应用ELISA法测定血清Vaspin水平,同时测定空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FINS）、血脂、糖化血红蛋白（Hb A1c）、尿素氮（BUN）、血肌酐（Cr）,采用稳态模型-胰岛素抵抗公式（HOMA-IR）评估胰岛素抵抗状态。结果血清Vaspin水平依次为对照组〈DN2组〈DN1组〈DM组，差异有显著性（P〈0．05）。DM组Vaspin水平与性别、甘油三酯（TG）、空腹血糖（FBG）、糖化血红蛋白（HbAlc）、空腹胰岛素（InFINS）、胰岛素抵抗指数（InHOMA—IR）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL—c）显著相关（r值分别为0．561，0．239，0．521，0．593，0．320，0．225，-0．357，P〈0．05）。DN组Vaspin水平与FBG、InFINS、InHOMA—IR、性别显著相关（r值-0．532，-0．276，-0．239，0．537，P〈0．05）。Logistic回归分析显示：Vaspin、HbAlc、BMI、InHOMA—IR为糖尿病肾病的危险因素。结论Vaspin在糖尿病肾病的发生中起重要作用。

Slit分泌蛋白家族2/Slit分泌蛋白家族特异性受体1在骨髓增生异常综合征中的表达及意义

目的探讨Slit分泌蛋白家族2/Slit分泌蛋白家族特异性受体1(Slit2/Robo1)在骨髓增生异常综合征(MDS)中的表达及临床意义。方法以2017年8月至2019年6月就诊于徐州医科大学附属医院的51例初诊MDS病人为研究对象,采用Ficoll密度梯度离心法分离51例MDS病人治疗前后骨髓单个核细胞,并通过实时定量PCR检测细胞中Slit2/Robo1mRNA的表达水平,采用蛋白质印迹法(Westernblotting)测定其蛋白表达。将Slit2/Robo1mRNA表达水平与临床参数进行相关性分析。以对照组Slit2、Robo1 mRNA表达水平为基线,分别将Slit2、Robo1 mRNA的表达量分为高表达组和低表达组,Kaplan-Meier法绘制生存曲线,并分析Slit2/Robo1 mRNA基因表达水平与MDS预后关系。结果初治组Robo1表达量明显高于正常对照组[(2.595±0.395)比(1.422±0.485)],而Slit2表达量明显低于正常对照组[(2.453±0.185)比(2.729±0.136)](P<0.05);中高危病人治疗后,有效组Robo1表达量降低,无效组升高,Slit2表达量则相反,有效组较前升高,无效组较前降低(P<0.05)。相关性分析结果显示,Robo1 mRNA表达水平与IPSS-R分组、骨髓原始细胞数、年龄均呈正相关(r=0.36,r=0.41,r=0.36),Slit2 mRNA表达水平与IPSS-R分组、骨髓原始细胞数、年龄均呈负相关(r=−0.83,r=−0.78,r=−0.53)。生存分析显示Robo1 mRNA相对表达水平与病人的总生存期(OS)及无进展生存期(PFS)呈负相关,而Slit2mRNA水平与病人的总生存期(OS)及无进展生存期(PFS)呈正相关(P<0.05)。结论Slit2/Robo1在MDS病人骨髓单个核细胞中表达,其在MDS的发生、发展及预后中起重要作用。

肝星状细胞特异性Grk2基因敲除小鼠模型的制备及鉴定

目的利用Cre-loxP基因敲除技术建立肝星状细胞特异性G蛋白偶联受体激酶2(G protein-coupled receptor kinase 2,GRK2)基因敲除小鼠模型,为研究GRK2在肝星状细胞中的生物学功能提供动物模型基础。方法将loxP标记的Grk2基因小鼠(Grk2^(fl/fl))和Lrat-Cre工具鼠进行多次繁殖,建立肝星状细胞特异性Grk2基因敲除(Grk2^(ΔHSC))小鼠模型。观察和分析小鼠的生长繁殖情况;通过PCR反应鉴定flox和Cre基因型;免疫荧光双染检测肝星状细胞中GRK2表达;Western blot检测小鼠肝星状细胞及肺、脾、肾脏、心脏组织中GRK2蛋白表达;HE染色观察肝脏及肺、脾、心脏、肾脏组织学形态。结果成功鉴定Grk2^(ΔHSC)小鼠基因型;两组小鼠体质量、繁殖能力无明显差异;免疫荧光双染及Western blot结果表明,Grk2^(ΔHSC)小鼠的肝星状细胞中GRK2蛋白水平明显低于对照组小鼠,Grk2^(ΔHSC)小鼠肺、脾、肾脏和心脏组织中GRK2蛋白表达与对照组相比无明显变化;HE染色结果显示,Grk2^(ΔHSC)小鼠肝脏及主要组织结构与Grk2^(fl/fl)相比差异无显著性,可用于后续研究。结论本研究应用Cre-loxP技术成功构建了肝星状细胞特异性Grk2基因敲除小鼠,为进一步研究GRK2在肝脏中的作用提供了优良工具。

脑特异性血管发生抑制剂1相关蛋白2基因与中国汉族注意缺陷多动障碍儿童执行功能的关联分析

目的探讨脑特异性血管发生抑制剂1相关蛋白2(brain-specific angiogenesis inhibitor 1-associated protein 2,BAIAP2)基因多态性与注意缺陷多动障碍(attention deficit/hyperactivity disorder,ADHD)及健康儿童执行功能之间的关联,并进一步探讨这种关联的性别和亚型特异性。方法采用横断面研究,纳入2005年5月至2011年1月于北京大学第六医院门诊就诊的ADHD儿童929例(ADHD组)及2005年1月至2010年1月在北京市中小学就读的健康对照儿童161名(对照组),采用Stroop色词命名测验、Rey复杂图形测验和连线测验评估所有受试者反应抑制、工作记忆及转换功能等执行功能。选择BAIAP2基因4个单核苷酸多态性位点,采用TaqMan^(TM)荧光探针杂交扩增的基因分型技术进行基因型检测。以性别、年龄和智商为协变量,采用协方差分析方法进行2组间执行功能的比较,并探讨BAIAP2基因多态性基因型与ADHD儿童及健康对照儿童执行功能的关联,及ADHD组中这种关联的性别、亚型特异性。结果ADHD组反应抑制功能(F=11.64、26.50,P≤0.001)及转换功能(F=25.68,P<0.001)均较对照组差。对照组中未发现任一BAIAP2基因位点与执行功能关联。在ADHD组中控制性别、年龄、智商后,BAIAP2基因的rs4969239位点与连线测验的转换时间具有统计学意义的关联(B=-17.55,F=7.13,P=0.008),AG+GG等位基因型携带者较AA基因型携带者转换时间长,转换功能较差;rs9901648位点与Stroop色词测验的颜色干扰时具有统计学意义的关联(B=1.82,F=8.84,P=0.003),AA基因型携带者较AG+GG等位基因携带者颜色干扰时更长,反应抑制功能较差。进一步分析显示,rs9901648位点与颜色干扰时的关联仅在男性ADHD儿童中具有统计学意义(F=11.33,P=0.001)。结论BAIAP2基因多态性位点可能与ADHD儿童转换及反应抑制等执行功能受损有关,其中BAIAP2基因多态性位点与反应抑制功能的关联主要存在男性ADHD儿童中。

TIMP-2基因转染豚鼠巩膜成纤维细胞基质金属蛋白酶2及其抑制剂表达

目的观察转染基质金属蛋白酶2抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase2,TIMP-2)基因的豚鼠巩膜成纤维细胞不同时间增生能力及基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase2,MMP-2)和TIMP-2的表达,探讨基因治疗近视的可行性。方法随机选取三色健康豚鼠,组织块法体外培养原代巩膜成纤维细胞,免疫组织化学法进行波形蛋白的鉴定,取第3～6代细胞进行实验。分子克隆构建携带TIMP-2基因的真核表达载体,转染豚鼠巩膜成纤维细胞,MTT法观察转染后12h、24h、48h、3d、5d、7d细胞增生能力。提取总RNA,二步法逆转录-聚合酶链反应检测MMP-2mRNA及TIMP-2mRNA的表达水平。结果豚鼠巩膜成纤维细胞原代、传代培养生长良好,波形蛋白鉴定阳性。转染3d、5d、7d TIMP-2基因转染组成纤维细胞的增生速度分别为0.6724±0.0092、0.7963±0.0060、0.8462±0.0064,明显快于正常对照组成纤维细胞(0.5810±0.0120、0.6525±0.0072、0.7129±0.0132),差异均具有显著统计学意义(均为P<0.01)。转染48h MMP-2mRNA表达即开始减少,转染3d时表达明显减少,达到最低,除转染12h与24h之间外,转染组与正常对照组、各转染不同时间组间MMP-2mRNA表达差异均有统计学意义(均为P<0.05)。TIMP-2mRNA表达在转染48h时即开始增加,除12h与24h外,转染组与正常对照组、各转染不同时间组间TIMP-2mRNA表达差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论转染TIMP-2基因对豚鼠巩膜成纤维细胞有促增生作用,TIMP-2基因转染豚鼠巩膜成纤维细胞抑制MMP-2mRNA的表达,可在一定程度上阻止近视发展中巩膜组织的丢失与重塑。

应用抑制性消减杂交技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白2反式调节基因

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白2(NS2)反式调节基因cDNA消减文库,研究HCVNS2蛋白的反式调节基因。方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术筛选转染pcDNA3.1(-)NS2和空载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞差异性表达基因,并进行生物信息学分析。结果:获得12个差异表达的已知蛋白基因和3个未知功能基因序列,包括:磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican3,GPC3)、酸性核糖体磷蛋白PO、核糖体蛋白L13a、整合素β1、天冬酰胺合成酶、信号肽酶、α2HS糖蛋白、小核糖体蛋白多肽G、蛋白酶样亚单位、黄体酮受体、SDR家族脱氢酶8、Ras家族RAB4A、具有BTB/POZ结构的新蛋白、具有coiled coil helix结构的新蛋白、未知功能基因。结论:成功构建HCVNS2反式调节的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制提供了线索。

诱导型巨噬细胞特异性敲除GRK2基因小鼠模型的构建及应用

目的 建立诱导型巨噬细胞特异性敲除G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)基因(GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+))小鼠模型。方法 基于Cre/LoxP系统构建GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠。通过PCR扩增程序及琼脂糖凝胶电泳鉴定GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠的基因型。二氧化碳法处死小鼠后,Western blot检测骨髓源巨噬细胞(BMDMs)和腹腔巨噬细胞(PMs)中GRK2表达。免疫荧光检测小鼠脑、心脏和脾脏巨噬细胞中GRK2表达。流式细胞术分析前列腺素E2(PGE2)诱导的PMs中M1/M2比例。结果 基因型鉴定结果表明,flox扩增产物长度在355 bp处有一条条带且Cre扩增产物长度在355 bp处有一条条带的小鼠即为GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠。Western blot结果显示,与GRK2^(flox/flox)小鼠相比,GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠BMDMs和PMs中GRK2表达降低(P<0.01)。免疫荧光结果显示,与GRK2^(flox/flox)小鼠相比,GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠脑、心脏和脾脏中GRK2表达降低(P<0.01)。流式细胞术结果显示,与GRK2^(flox/flox)小鼠相比,GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠PMs中CD86/CD206比例变化差异无统计学意义。在PGE2(10μmol/L)刺激下,GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠PMs中CD86/CD206比例升高(P<0.01),且GRK2^(flox/flox)小鼠PMs中CD86/CD206比例高于GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠(P<0.01)。结论 该研究成功构建出GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠模型,且该小鼠可促进PGE2诱导的PMs向M2型巨噬细胞极化。

小鼠抗人密封蛋白18剪接变异体2(Claudin18.2)CAR-T细胞的构建及体外功能验证

目的筛选一种抗人密封蛋白18剪接变异体2(Claudin18.2)的单克隆抗体(mAb),并基于该抗体序列构建靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞,用于开发CAR-T细胞疗法。方法用人Claudin18.2抗原免疫小鼠,取小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合,经筛选获得小鼠抗人Claudin18.2 mAb。以抗体序列为模板PCR扩增出重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)序列,用接头(linker)连接成单链抗体(scFv),并用此scFv构建CAR。将CAR克隆至慢病毒表达载体中,用包装好的慢病毒感染T细胞制备出抗Claudin18.2 CAR-T细胞。结果筛选到的小鼠抗人Claudin18.2 mAb对人和鼠的Claudin18.2抗原都有结合能力,亲和力高于对照抗体。构建的CAR-T细胞在效靶比1∶9时,对过表达Claudin18.2的阳性靶细胞的杀伤率在50%~70%。结论制备的小鼠抗人Claudin18.2 mAb具有人鼠双种属特异性,组织特异性良好,亲和力高。构建的anti-Claudin18.2 CAR-T细胞对靶细胞具有良好杀伤效果。

皮肌炎自身特异性抗体与皮肌炎相关性恶性肿瘤的研究进展

皮肌炎是一种自身免疫性疾病,且常伴发恶性肿瘤。超过50%的皮肌炎患者体内存在肌炎自身特异性抗体。皮肌炎自身特异性抗体[抗迁移抑制因子(migration inhibitory factor,Mi)-2抗体、抗核小体蛋白(nuclear matrix protein,NXP)-2抗体、抗转录中介因子(transcription intermediary factor,TIF)1-γ抗体、抗小泛素样修饰物激活酶(small ubiquitin-like modifier activating enzyme,SAE)抗体]在皮肌炎相关性恶性肿瘤的发病机制中扮演着重要角色。揭示皮肌炎自身特异性抗体在皮肌炎并发恶性肿瘤中的作用,可为准确评估皮肌炎患者发展为恶性肿瘤的风险提供重要依据,也可为临床诊断皮肌炎和精准的个体化治疗提供新思路。

用抗IL-2受体单克隆抗体抑制移植免疫反应

用于脏器移植后的免疫抑制剂硫唑嘌吟和类固醇激素等可降低正常免疫反应,常出现感染等合并症。有一定选择性的环孢素A(CYA)也不能降低感染的发生率,仅能选择性地抑制移植免疫反应,故只有寄希望于免疫学方法。移植免疫反应首先是T细胞活化。白介素-2受体(IL-2R)主要存在于活化的T细胞,即杀伤T细胞(TK)的前期细胞膜上。TK前期细胞通过IL-2增殖分化,与活化TK在同种移植排斥反应中起主要作用。静止T细胞和记忆T细胞无IL-2R,故认为抗IL-2R单克隆抗体(McAb)能阻止受抗原剂激的T细胞活化,选择性地抑制移植免疫反应。用细胞融合法和纯株培养法,在鼠和人制成具有种族特异性的抗IL-2RMcAb,可阻止IL-2与IL-2R结合,抑制T细胞增生。

抗HER2单链抗体融合凋亡蛋白对SKOV3细胞的靶向杀伤

目的 :探讨分泌表达的抗HER2单链抗体与重构型人caspase 3融合蛋白对HER2抗原阳性肿瘤细胞的靶向杀伤作用。方法 :将重构型人caspase 3基因亚克隆入pCMV e2 3scFv PEII PEIII的相应位点 ,构建重组真核表达载体 pCMV e2 3scFv PEII revcasp3,并转染人T淋巴瘤细胞系Jurkat,筛选并建系。用ELISA检测培养上清中融合蛋白的分泌表达。通过共培养实验观察含有该融合蛋白的培养上清对人卵巢癌细胞SKOV3生长的抑制作用。结果 :融合蛋白基因可在Jurkat细胞中 ,分泌表达并杀伤SKOV3细胞。结论 :分泌表达的抗erbB2单链抗体与重构型人caspase