胰岛素样生长因子Ⅱ基因启动子P3甲基化状态与涎腺多形性腺瘤发生的关系

目的:检测胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)启动子P3在涎腺多形性腺瘤(SPA)中的甲基化状态。方法:收集26例SPA组织及瘤旁相对应的正常涎腺组织,10例涎腺恶性肿瘤(恶性多形性腺瘤除外)及10例正常涎腺组织,应用巢式甲基化特异性PCR(nMSP)检测IGF-Ⅱ启动子P3的甲基化状态。对其中10个样本(SPA及正常组织3对,恶性肿瘤及正常组织2对)采用焦磷酸测序(pyrosequencing)检测。结果:9例SPA中IGF-Ⅱ启动子P3呈低甲基化状态改变,其余为部分甲基化和甲基化。正常涎腺组织及涎腺恶性肿瘤组织未出现低甲基化改变。结论:IGF-Ⅱ启动子P3低甲基化可能在涎腺多形性腺瘤的发生发展中具有一定的作用。

前列腺癌特异性启动子P(A)PTp的构建及评价

目的构建前列腺癌特异性启动子PSAe(AREc)-PSMAe-TARPp[P(A)PTp],并在腺病毒水平评价其启动目的基因表达的效率和特异性。方法巢式PCR扩增基因组DNA获得PSAe的AREc区基因、PSMAe基因和TARPp基因,并依次连接获得嵌合启动子P(A)PTp。采用Adeasy系统构建并制备P(A)PTp启动增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)表达的重组腺病毒Ad-pSh-P(A)PTp-EGFP。不同感染复数(multi-plicity of infection,MOI)的Ad-pSh-CMV-EGFP感染各细胞系后48 h,流式细胞术确定最佳MOI;并以最佳MOI的Ad-pSh-P(A)PTp-EGFP感染各细胞系,检测EGFP的表达效率。结果 PCR成功扩增并连接获得嵌合启动子基因P(A)PTp。采用Adeasy系统,构建并制备了重组腺病毒Ad-pSh-P(A)PTp-EGFP。Ad-pSh-CMV-EGFP感染后,流式检测结果显示,前列腺癌细胞PC3和PC3M细胞的最佳MOI为100 MOI;而前列腺癌细胞DU145以及肝癌细胞SMMC-7721和HepG2为250 MOI。最佳MOI的Ad-pSh-P(A)PTp-EGFP感染后,EGFP在各细胞系中的表达效率[P(A)PTvsCMV]为:PC3(25.56%vs77.76%)、DU145(50.50%vs65.26%)、PC3M(30.81%vs89.70%)、HepG2(6.26%vs63.76%)、7721(2.27%vs67.84%)。结论成功构建前列腺癌特异性嵌合启动子P(A)PTp,并证实能在前列腺癌细胞中特异并有效地启动EGFP的表达。

巢式甲基化特异性聚合酶链反应在p16基因启动子过甲基化检测中的应用

目的 介绍巢式甲基化特异性聚合酶链反应 (nMSP)法 ,探讨了最佳PCR扩增条件 ,并用该法分析新鲜癌组织、石蜡包埋组织及肿瘤患者血清中p16基因启动子的甲基化状态。方法 将基因组DNA变性成为单链 ,用亚硫酸氢盐修饰单链DNA ,将所有未甲基化的胞嘧啶被转变为尿嘧啶 ,而甲基化的胞嘧啶则不变。设计针对甲基化和非甲基化等位基因特异引物 ,进行巢式聚合酶链反应扩增 ,最后经凝胶电泳检测目的片段。结果 在 3种类型的标本中都检测出了p16基因启动子甲基化。用甲基化特异性聚合酶链反应法 (MSP)和nMSP法分别检测 34例非小细胞肺癌 (NSCLC)患者血清 ,p16基因启动子甲基化阳性率分别为 5 3% (18/34)和 74 % (2 5 /34) ,nMSP法具有更高的灵敏度。结论 筑巢式甲基化特异性聚合酶链反应是一种灵敏度高、特异性强的甲基化检测方法 ,可广泛应用于不同类型标本基因启动子甲基化分析。

鼻咽癌组织中P14ARF和P15INK4B基因异常甲基化的研究

目的 通过检测P14肝和P15INK4B基因启动子区甲基化情况,分析其与鼻咽癌发生、发展及临床病理特征的关系,探讨其可能在鼻咽癌临床早期分子生物学诊断和治疗中的作用.方法 运用甲基化特异性聚合酶链式扩增对54例鼻咽癌组织和20例正常鼻咽上皮组织的P14ARF和P15INK4B基因启动子区甲基化状态进行检测,比较两者的差异,并分析鼻咽癌组织中两种基因甲基化与患者临床病理特征的关系,以及两种基因甲基化的相关性.结果 鼻咽癌组织中P14ARF和P15INK4B基因启动子区甲基化阳性率分别为20.4%(11/54)和22.2%(12/54),两者总检出率为27.8%(15/54);而正常鼻咽上皮组织中未检测到P14ARF和P15INK4B基因启动子区甲基化;两组间P14ARF和P15INK4B基因启动子区甲基化阳性率差异有统计学意义(P<0.01).15例甲基化的癌组织同时两种基因同时甲基化为8例,非甲基化39例.P14ARF和P15INK4B基因甲基化与鼻咽癌的临床病理特征均无明显相关性(均P>0.05).结论 P14ARF和P15INK4B基因启动子区甲基化在鼻咽癌的发生、发展中可能存在协同作用,作为鼻咽癌发生的早期事件,有望成为分子生物学早期诊断的标志物,将来还可能作为去甲基化基因治疗的靶点.

P119驱动amiRNA介导的PL基因沉默对草莓果实硬度的影响

果胶裂解酶基因(Pectate lyase,PL)是调控果实软化的重要靶点。本研究测定了红颜草莓果实在发育过程中果胶裂解酶活性变化和硬度变化规律,并通过人工小干扰RNA(artificial micro-interfering RNA interference,amiRNA)技术,以拟南芥miR390a前体序列作为沉默PL基因的骨架,在番茄果实特异性启动子P119的驱动下,通过农杆菌介导转入草莓果实中瞬时表达,通过RT-PCR分析草莓瞬时转染后PL基因的表达量,并检测了PL沉默对果实硬度的影响。结果表明,随着草莓果实发育的推进,果胶裂解酶活性呈逐渐上升趋势,与果实硬度呈负相关;构建了基于拟南芥miR390a为骨架的amiRNA靶向栽培草莓中的PL基因;在番茄果实特异性启动子P119驱动下,miRNA前体可以在草莓果实中瞬时表达;草莓果实中总PL基因表达量下降达34. 5%;基因沉默组果实硬度比对照组更高,且沉默对果实颜色发育进程无明显影响。该结果表明:果胶裂解酶主要在果实发育后期调节细胞壁的解离,采用amiRNA沉默PL基因可以延缓草莓果实软化进程。

胃癌手术前后血浆中p16基因的异常甲基化检测

目的:研究胃癌患者手术前后外周血浆、对应原发肿瘤以及癌旁组织中p16基因启动子区异常甲基化的检出状况,探讨其在胃癌疗效评估中的应用.方法:采用甲基化特异性PGR方法,扩增84例胃癌患者的原发肿瘤、癌旁组织、手术前血浆中pl6基因启动子区,以及上述患者中30例行胃癌根治性手术患者术后14～21天血浆中p16基因启动子区,以15例健康人血浆作为正常对照.采用凝胶电泳-溴乙锭显色以及高效液相色谱两种方法检测产物.结果:84例患者样品中,原发肿瘤中存在pl6基因异常甲基化26例(31.0%),癌旁组织中阳性2例(0.02%),术前血浆中阳性12例(14.3%),15例健康人血浆检测均为阴性.患者血浆阳性者同时也存在对应肿瘤组织阳性.30例同时有手术前后血浆标本的胃癌根治手术患者中,原发肿瘤组织中p16异常甲基化14例,其中6例术前血浆阳性,术后5例转阴.在检测样本中,高效液相色谱的检测结果与凝胶电泳-溴乙锭显色结果一致.结论:胃癌患者外周血浆中可以检测到与原发肿瘤一致的p16异常甲基化,手术后血浆中p16甲基化状态的变化与手术治疗有关,高效液相色谱作为一种便捷的技术可以应用于PCR产物的检测.

抑癌基因p16和RASSF1A启动子甲基化与乳头状甲状腺癌的相关性研究

乳头状甲状腺癌（PTC）是甲状腺最常见的恶性肿瘤,目前国外有少量研究报道甲状腺癌的发生与p16和RASSF1A两种抑癌基因启动子的高甲基化密切相关,本研究采用RT-PCR和甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR,MSP）法对PTC及对照组织进行研究,以探讨这两种抑癌基因启动子的高甲基化与PTC的发生是否有关.

人胃癌细胞肿瘤相关基因的表达与甲基化调控

目的:旨在阐明胃癌的发生中多种抑癌基因和癌基因的甲基化情况,以期为进一步深入探索通过改变抑癌基因的甲基化而为胃癌治疗提供新方法. 方法:培养人胃癌细胞株MKN-45和HGC-27两种细胞,在MTT确定去甲基化制剂5-氮脱氧胞苷(5-aza- 2’-deoxycytidine,5-aza-dC)浓度和时间对细胞生长活力没有影响后,分别以2,5,和10μmol/L,浓度分别干预24和72 h,然后提取其DNA和RNA,用RT-PCR的方法检测p16INK4A,p21WAF1,p53,c-Ha-ras和c- myc等多种基因的表达情况;同时以流式细胞仪分析药物干预后的MKN-45和HGC-27的细胞周期变化; DNA分析则通过亚硫酸氢盐修饰和测序和甲基化特异性PCR(MSP)的方法检测p16INK4A基因及c-myc启动子区甲基化的情况. 结果:我们所采用的5-aza-dC的浓度和时间对细胞的生长无显著性影响.5-aza-dC干预前,MKN-45和HGC-27两种胃癌细胞系中均有p16INK4A表达,5-aza- dC干预后在MKN-45和HGC-27两种胃癌细胞系中p16INK4A的表达增强,且不同的胃癌细胞株表达增强最明显时的时间与浓度不同.-p53,p21WAF1,c-myc,c-Ha-ras 等多种基因在干预前后均有表达,且在干预前后无明显变化.在5-aza-dC干预后,HGC-27细胞周期阻滞在G1期,而MKN-45细胞的周期无明显改变.p16INK4A启动子区存在甲基化使得该基因的表达减少,在去甲基化试剂处理后使其表达增强. 结论:人胃癌细胞系MKN-45和HGC-27中,p16INK4A 启动子甲基化是其在表达减弱的主要原因,其去甲基化程度取决于5-aza-dC干预的时间和浓度.

乳腺癌中p16^INK4a和视网膜母细胞瘤基因甲基化状况及其表达

为了研究乳腺癌及癌旁增生组织中p16^INK4a和视网膜母细胞瘤（RB）基因启动子区域的甲基化状况，并探讨基因异常甲基化与蛋白表达及其临床意义，包头医学院第一附属医院病理科赵英芳等采用甲基化特异性PCR方法对46例乳腺癌、