沈阳汉族群体HLA Ⅰ类基因座PCR-序列特异性寡核苷酸探针分型研究

目的检测和分析沈阳汉族HLA-A、-B、-Cw位点等位基因的多态性。方法采用聚合酶链反应-寡核苷酸探针杂交分型方法对108名沈阳籍健康献血员进行HLA-A、-B、-Cw等位基因分型。结果检出等位基因HLA-A位点21个,B位点43个,Cw位点23个;所有位点的等位基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡。结论从基因水平分析了HLAⅠ类基因的群体分布特征,提供了沈阳汉族群体HLAⅠ类基因座更准确的基因频率。

流式细胞仪结合序列特异性寡核苷酸探针基因分型方法在血小板供者资料库建立中的应用

目的探讨高通量流式细胞仪结合序列特异性寡核苷酸探针（FLOWlSs0）技术在人类血小板抗原（HPA）基因分型中的应用。方法采用FLOW—SSO技术对1378例汉族血小板捐献者HPA1～6，15系统的基因型进行检测；并以10份国际输血协会（IsBT）第12届血小板免疫学术研讨会提供的质控样品对FLOW-SSO技术的可靠性进行考核。以3家供应商提供的不同聚合酶链反应一序列特异引物法（PCR—SSP）试剂，对50份血小板样品的基因分型结果进行比对试验。分型结果采用Y。检验考察HPA系统的基因型频率分布是否符合Hardy—Weinberg遗传平衡定律。结果通过FLOW-SSO方法获得的1379例血小板供者HPA等位基因频率如下，HPA—1a为0．9927，HPA-1b为0．0073，HPA-2a为0．9536，HPA-2b为0．0464，HPA-3a为0．5700，HPA-3b为0．4300，HPA-4a为0．9982，HPA-4b为0．0018，HPA-5a为0．9804，HPA-5b为0．0196，HPA-6a为0．9822，HPA-6b为0．0178，HPA-15a为0．5337及HPA-15b为0．4663。基因频率检测结果经Y。检验，其分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。ISBT提供的10份样品考核结果相符率为100％。50份血小板样本采用3种不同的PCR—SSP试剂测定的HPA1～6，15基因分型结果，与FLOW—SSO技术测定结果完全一致。结论FLOW—Ss0基因分型技术有便捷、重复性好及高通量等特点，适用于血小板供者资料库的血小板基因分型。

抗体Fc片段特异寡核苷酸配基介导的实时定量免疫PCR

目的:利用小鼠IgG抗体Fc片段高特异、高亲和寡核苷酸配基,构建实时定量免疫PCR检测方法,提高抗体检测的灵敏度。方法:用SELEX技术从随机寡核苷酸文库中筛选抗体Fc片段特异寡核苷酸配基,设计合成信标序列,通过不对称PCR法,制备IgG Fc片段的核酸信标配基分子;32P标记核酸信标配基,采用琼脂糖凝胶阻滞双显色法鉴定核酸信标配基与IgG Fc片段结合的亲和力和特异性;制备IgG Fc特异性寡核苷酸信标配基-抗体复合检测分子,构建小鼠IgG Fc片段特异核酸信标配基介导的实时定量免疫PCR检测方法。结果:制备了IgG Fc片段的核酸信标配基分子;凝胶阻滞放射自显影和考马斯亮蓝二次染色结果显示该核酸信标配基分子与IgG Fc片段具有高度亲和力和活性,而且只与非变性IgG结合,与变性IgG不结合;IgG Fc片段的特异核酸信标配基与IgG结合形成复合检测分子,有效完成了信号传递和实时定量PCR信号放大过程。结论:初步建立了一种全新的核酸信标配基介导的免疫PCR检测方法,可有效提高现有IgG类抗体免疫检测的灵敏度和特异性。

36380名河北汉族HLA供者基因多态性及其分布特征

目的了解河北省汉族人群人类白细胞抗原HLA-A、B、DRB1基因多态性及分布特征。方法采用序列特异性寡核苷酸探针聚合酶链反应(PCR-Sequence Specific Oligonueleotide Probing,PCR-SSOP)方法,对36 380名河北汉族捐献造血干细胞健康志愿者的HLA-A、B、DRB1基因作低分辨基因分型检测,采用方根法计算HLA-AB、DRB1基因频率,并进行群体比较。结果河北汉族人群中共检出18个HLA-A基因43个HLA-B基因和14个HLA-DRB1基因,呈现较高的基因多态性,包括过去很少被检测到的HLA-A*25,A*74,B*42,B*53,B*73,DR*18。,其中A座位最常见基因依次为:A*02、A*11、A*24、A*30、A*01、A*03、A*33 B座位最常见基因依次为:B*13、B*1501(B62)、B*51、B*4002(B61)、B*4001(B60)、B35,B46DRB1座位最常见基因依次为DRB1*15、DRB1*07、DRB1*09、DRB1*12、DRB1*04、DRB1*11和DRB1*14,结论河北汉族人群HLA-A、B、DRB1基因分布有自己的特点,各基因频率介于南北汉族之间,但更接近于中国北方汉族人群,符合地域分布特征。

Flow-rSSO及PCR-SBT方法检测KIR基因有无的对比研究

目的研究流式磁珠序列特异性寡核苷酸探针(Flow-rSSO)杂交及测序分型(PCR-SBT)方法鉴定KIR基因有无的一致性。方法对131例汉族人群的DNA标本采用Flow-rSSO方法鉴定全部16种KIR基因的有无,并采用本实验室建立的PCR-SBT方法对14种功能性KIR基因进行高分辨水平基因检测;分析Flow-rSSO及PCR-SBT两种方法鉴定14种功能性KIR基因有无的一致性。对初检结果不一致的标本,采用同一厂家、不同批号的Flow-rSSO试剂盒进行复检,并采用序列特异性引物-PCR(PCR-SSP)方法进行检测。结果131例标本中有129例完全一致,2例不一致,占1.5%(2/131)。不一致的两例标本,1例标本3DL1基因、另1例标本2DS3及2DS5基因,其Flow-rSSO初检结果均为阴性,而PCR-SBT结果均为阳性。更换新的批号Flow-rSSO试剂盒复检,两例标本的结果均为阳性;采用PCR-SSP方法检测的结果亦为阳性。结论经Flow-rSSO试剂盒检测KIR基因有无,出现2例标本初检结果错误,提示检测KIR基因有无时,试剂的质控工作至关重要。

运用二代测序技术确认PCR-SSOP法检出的HLA罕见等位基因

目的:确认PCR-序列特异性寡核苷酸探针(SSOP)法检出的4例磁珠探针HLA基因分型结果格局异常和3例模棱两可结果样本的HLA真实基因型。方法:对HLA高分辨组织配型血样采用PCR-SSOP法检出的4例磁珠探针HLA基因分型结果格局异常和3例模棱两可结果进一步采用PCR-直接测序分型(SBT)技术和二代测序(NGS)技术复检确认。结果:采用PCR-SSOP方法检出4例磁珠探针HLA基因分型结果格局异常的样本,加做SBT及NGS两种方法复检后结果显示,样本1的HLA-A分型结果与已知基因型不完全匹配,NGS分析显示,该等位基因与同源性最接近的等位基因A*31:01:02:01在第2外显子154位G>A变异,导致28位编码氨基酸由缬氨酸变为蛋氨酸(p.Val28Met),样本2的HLA-C结果为C*03:119, 06:02,样本3的HLA-C结果为C*03:03, 07:137,样本4的HLA-B结果为B*55:02,55:12。采用PCR-SSOP方法检出3例模棱两可结果样本,加做SBT及NGS两种方法复检后结果显示,样本5的HLA-B结果为B*15:58, 38:02,样本6的HLA-DRB1结果为DRB1*04:05, 14:101,样本7的HLA-DQB1结果为DQB1*03:34,05:02。其中等位基因C*03:119、C*07:137和DRB1*14:101均未收录于中国造血干细胞捐献者资料库的常见及确认等位基因(CWD)表2.4版本。结论:PCR-SSOP法磁珠探针HLA基因分型结果格局异常提示可能为HLA罕见等位基因或新等位基因,需要测序验证。

西藏珞巴族HLA-DRB1基因多态性

目的:检测西藏珞巴族HLA DRB1等位基因及基因型频率,并将其与18个人群的HLA DRB1频率进行比较,绘制系统发生树。方法:应用聚合酶链反应序列特异性寡核苷酸探针(PCR SSO)技术,对我国西藏南部林芝地区3代内无血缘关系的92个珞巴族健康个体进行了HLA DRB1位点的基因分型。采用不加权配对组算术方法(UPGMA)绘制系统发生树。结果:在92例珞巴族个体的184个等位基因中共检出11种HLA DRB1等位基因,其中HLA DRB1*04(27. 20% ),DRB*12(25. 50% )在珞巴族中最常见,共占珞巴族可检出等位基因的52. 70%;其他频率大于5%的等位基因还有DRB1*14(15. 20% ),DRB1*15(9. 80% )和DRB1*08(8. 20% )。结论:西藏珞巴族HLA DRB1等位基因分布与其他华人群体均存在很大的差异,显示其HLA等位基因频率分布的民族独特性;在遗传距离上珞巴族和藏族最近,这与民族学、历史学和社会学研究结果相一致。

PCR-RSSO基础上HLA-Ⅰ、Ⅱ基因分型的研究

目的：通过对PCR－DNA技术的分析，探讨人类白细胞抗原（HLA）基因分型方法。方法：采用PCR反向序列特异性寡核苷酸（polymerase chain reaction-reverse sequence specific oligonucleotide,PCR-RSSO)杂交技术，建立改良半量扩增体系全自动HLA－I、Ⅱ等位基因分型方法，进行了635份血液标本HLA－A、B、C、DR、DQ等位基因分型，其中166份DNA同时采用序列特异性引物技术（PCR－SSP）和手工全量扩增体系PCR－RSSO技术。对全自动半量PCR－RSSO、PCR－SSP、手工PCR－RSSO 3种方法做两两比较。结果；全自动半量PCR－RSSO的分型成功率为98．4％（3124／3175），PCR－SSP为98．8％（656／664），手工PCR－RSSO为88．3％（733／830）。经χ^2检验，全自动半量PCR－RSSO与PCR－SSP的分型成功率无统计学差异，与手工PCR－RSSO有显著差异（P＜0．05）。结论：PCR－RSSO可识别HLA－I、Ⅱ共706个等位基因，覆盖WHO命名委员会2000年公布的36个等位基因的75．43％；对706个HLA等位基因的分型均为中－高分辨率，有分辨纯合子等位基因的能力；易长期保存书面的实验原始资料，即杂交条；具有成本低、劳动强度低、省时和DNA消耗量少等优点。PCR－RSSO适合于造血干细胞移植和建立造血干细胞及脐带血干细胞库的组织配型。

应用反向斑点杂交技术进行脐血HLA-DRB基因分型方法的建立

HLA分子的多态性对于移植有十分重要的意义。常用的HLA基因分型方法中SSOP基因分型方法有较高分辨率 ,但操作过程复杂 ,仅适于大样本的HLA分型。PCR SSP基因分型方法分辨率较低 ,但操作过程简单 ,适于临床要求。有必要建立一种简便、快速、价廉、高分辨率的基因分型方法。本研究取 6 3份已知HLA DRB型的脐血标本 ,经盐酸胍方法提取DNA用于反向斑点杂交 (RDB)基因分型 ,同时采用SSOP和PCR SSP方法进行比较。结果表明 ,所有样本用RDB方法基因分型均获得成功 ,可准确地分辨 6 0个HLA DRB等位基因 ,且结果与用SSOP和PCR SSP方法的结果完全一致。结论提示 ,RDB方法可准确地分辨HLA DRB等位基因 ,分辨率高 ,操作简单 。

河南人群病毒性丙型肝炎与HLA多态性的关联研究

目的了解河南地区病毒性丙型肝炎和HLA多态性的相关性,为丙型病毒性肝炎的预防、治疗以及预后提供理论依据。方法本研究从河南某医院随机抽取110例临床上确诊为病毒性丙型肝炎的患者为研究对象,并以河南省红十字血液中心3 874名健康献血者为对照,采用聚合酶链-序列特异性寡核苷酸链技术(polymerse chain reaction-sequence-specific oligonucleotide,PCR-SSO)对HLA-Ⅰ类(A和B)和Ⅱ类(DRB1)基因进行分型。通过比较分析2组研究对象间HLA等位基因频率分布差异,找出HLA多态性和病毒性丙型肝炎的相关性。结果在低分辨水平上,A*03在健康对照组中更为常见;而A*29、B*51则在慢性HCV感染组中频率更高。这说明在HCV感染时,A*03可能是保护机体的基因,而A*29、B*51与促进感染发生具有一定的相关性。在高分辨水平上,A*03:01在健康对照组中更为常见;而A*29:01、A*33:01、B*07:05、B*13:01、B*27:03、B*44:02、DRB1*08:01、DRB1*14:01则在慢性HCV感染组中频率更高。这说明在HCV感染时,A*03:01可能是保护机体的基因,而A*29:01、A*33:01、B*07:05、B*13:01、B*27:03、B*44:02、DRB1*08:01、DRB1*14:01与感染发生具有一定的相关性。结论我们的研究反映了河南地区人群中病毒性丙型肝炎与HLA多态性的相关性,为丙型病毒性肝炎的预防、治疗以及预后提供理论依据。

人类白细胞抗原-DQB1与儿童十二指肠溃疡和幽门螺杆菌感染的相关性研究

目的探讨人类白细胞抗原(HLA)-DQB1等位基因与儿童十二指肠溃疡(DU)和幽门螺杆菌(H.pylori)感染的遗传关联性。方法采用非同位素标记的聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSO)杂交的方法,对上海地区汉族健康儿童80例、DU患儿58例的HLA-DQB1等位基因进行分型;并同时检测DU患儿H.pylori感染情况。结果在DU患儿中,HLA-DQB1×05031等位基因频率明显高于正常健康儿童(分别为:6.02%、0.63%,P<0.05,RR=9),而在H.pylori阳性和H.pylori阴性DU组之间差异无显著性。结论HLA-DQB1×05031与DU呈正相关,DU患儿与正常对照组儿童之间存在着遗传学的差异;虽然H.pylori感染是DU的重要致病因素,但HLA-DQB1×05031并不是通过H.pylori感染而影响DU的遗传易感性。

流式磁珠反向SSOP杂交法误判HLA基因型的原因分析(附4例报告)

目前对人类白细胞抗原的基因分型技术有多种,包括序列特异性引物-聚合酶链反应（polymerase chain reaction with sequence-specific primers,PCR-SSP）,多聚酶链反应序列特异性寡核苷酸探针（PCR-sequence specific oligonucleotide probe,PCR-SSOP）杂交法,基因芯片法和DNA直接测序法（sequence-based typing,SBT）。基于Luminex的流式磁珠反向SSOP杂交法具有快速、高准确率、高通量、重复性好等优点,

广东汉族慢性粒细胞白血病患者HLA-DRB1基因多态性研究

目的:探讨广东汉族人群HLA-DRB1等位基因多态性与慢性粒细胞白血病(CML)患者的遗传关联。方法:采用聚合酶链反应和序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSO)对170例广东汉族CML患者和300例正常对照组HLA-DRB1等位基因多态性进行研究。结果:与正常对照组相比,CML组HLA-DRB14等位基因频率(6.18%)显著下降(x2=4.4486,P<0.05)。结论:广东汉族人群HLA-DRB14等位基因对CML患者有遗传拮抗作用。

流式磁珠PCR-SSOP方法HLA基因分型可疑结果的确认分析

目的对PCR-SSOP方法未明确HLA分型结果的可疑样本进一步分型,并分析原因。方法对采用PCRSSOP方法进行HLA分型出现的131例可疑样本采用LABScan3D分型方法进行检测。对于3D分型仍不能确定的样本采用PCR-SBT分型方法进行检测。结果 131例可疑样本分析,其中87例LABScan3D分型方法可确定分型结果,余下的44例采用PCR-SBT获得分型结果,3种分型方法检测结果在低分水平上是完全一致的。结论 LABScan3D分型方法在PCR-SSOP的基础上进一步发展,可代替其进行大量样本的HLA分型,但是仍有引物探针的局限,不能代替SBT的地位。

反向点杂交法检测中国人N-乙酰化酶基因型

目的 建立快速方便的反向点杂交法 (RDB)检测中国人N 乙酰化酶 (NAT2 )基因型。方法 采用PCR法扩增生物素标记的DNA片段 ,与固定在尼龙膜上的等位基因特异性寡核苷酸探针进行杂交 ,通过非同位素法显色检测杂交结果 ,分析NAT2 5种主要突变位点。用本法对 4 8名肺结核患者NAT2基因型进行了分析。结果 RDB法与等位基因特异扩增法结果完全一致。 4 8名肺结核患者NAT2 5、 6、 73种突变型等位基因的基因频率分别为 1 0 4 %、2 2 9%和 15 6 %。野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子分别为 33 3%、5 4 2 %和 12 5 %。结论 RDB法检测NAT2基因型准确、方便 ,适用于指导临床合理用药。

河南人群病毒性乙型肝炎与HLA多态性的关联研究

目的了解河南地区病毒性乙型肝炎和HLA多态性的相关性,为乙型病毒性肝炎的预防、治疗以及预后提供科学理论依据。方法本研究以河南某医院202名临床上确诊为慢性病毒性乙型肝炎的患者为研究对象,并以本中心3 874名健康献血者为对照,采用聚合酶链-序列特异性寡核苷酸链技术(Polymerse Chain Reaction-SequenceSpecific oligonucleotide,PCR-SS0)对HLA-Ⅰ类(A和B)和Ⅱ类(DRB1)基因进行分型。通过比较分析2组研究对象间HLA等位基因频率分布差异,以找出HLA多态性和病毒性乙型肝炎的相关性。结果在低分辨水平上,B*07、DRB1*13、DRB1*15在健康对照组中更为常见;而A*24、A*31、B*51、DRB1*11、DRB1*12则在慢性HBV感染组中频率更高。这说明在HBV感染时,B*07、DRB1*13、DRB1*15可能是保护机体的基因,而A*24、A*31、B*51、DRB1*11、DRB1*12可能是促进感染发生的基因。在高分辨水平上,B*07∶02、B*13∶02、B*15∶18、DRB1*13∶02、DRB1*15∶01在健康对照组中更为常见;而A*02∶01、A*24∶02、A*31∶01、A*33∶01、B*07∶05、B*13∶01、B*15∶01、B*15∶05、B*18∶01、B*27∶03、B*40∶02、B*44∶02、B*51∶01、B*54∶01、DRB1*04∶03、DRB1*08∶01、DRB1*11∶01、DRB1*12∶01、DRB1*14∶01则在慢性HBV感染组中频率更高。这说明在HBV感染时,B*07∶02、B*13∶02、B*15∶18、DRB1*13∶02、DRB1*15∶01可能是保护机体的基因,而A*02∶01、A*24∶02、A*31∶01、A*33∶01、B*07∶05、B*13∶01、B*15∶01、B*15∶05、B*18∶01、B*27∶03、B*40∶02、B*44∶02、B*51∶01、B*54∶01、DRB1*04∶03、DRB1*08∶01、DRB1*11∶01、DRB1*12∶01、DRB1*14∶01可能是促进感染发生的基因。结论我们的研究反映了河南地区人群中病毒性乙型肝炎与HLA多态性的相关性,为乙型病毒性肝炎的预防、治疗以及预后提供科学理论依据。

一例白血病患者及家系HLA-B基因全长序列及18个点突变分析

背景:人类白细胞抗原HLA经过长期进化形成丰富的多态性,近几年由于受检人数增加及HLA分型技术快速发展,HLA新基因不断被发现。目的:采用下一代测序技术对1例白血病患者及家系HLA-B基因的全长序列及18个点突变进行分析。方法:应用序列特异性寡核苷酸探针杂交(PCR-SSOP)及聚合酶链反应-直接测序法(PCR-SBT)发现患者的HLA-B结果异常。为了鉴定该基因,采用下一代测序技术对该基因全长进行测序,同时采集患者父亲、母亲及2位同胞姐妹的血样进行HLA基因的遗传学分析。结果与结论:应用序列特异性寡核苷酸探针杂交及聚合酶链反应-直接测序法均提示该样本HLA-B无完全匹配的基因型。应用下一代测序技术分析发现,与同源性最高的等位基因B*15:09:01相比,该基因在外显子、内含子和3′UTR共存在18个碱基突变。5个外显子碱基突变位于第3,4外显子,分别为:第486位G→C、第583位T→C、第636位T→C、第652位A→G和第756位C→T,导致5个相应密码子发生改变,其中2个碱基替换为错义突变,第171位酪氨酸(Tyr)→组氨酸(His)、第194位异亮氨酸(Ile)→缬氨酸(Val)。家系调查显示患者HLA-B新基因来源于父亲。新基因序列已递交给Genbank数据库(MG595995)。应用下一代测序技术鉴定了1个HLA-B新等位基因,该基因于2017年12月被WHOHLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*15:435。

流式细胞术检测HLA-B27阴阳性判读标准的建立及灰区样本的基因型分析

目的建立流式细胞术(FCM)检测人类白细胞抗原(HLA)-B27的阴阳性判读标准,同时探讨灰区样本的特性及应对措施。方法采用FCM检测132例腰背关节痛患者外周血HLA-B27的表达,以流式反向序列特异性寡核苷酸探针(Flow-rSSO)法检测患者HLA-B位点的分型。结果FCM和Flow-rSSO法检测HLA-B27的阳性率分别为18.18%和73.48%。根据FCM HLA-B27试剂盒推荐的判读规则,灰区样本45例,经Flow-rSSO法验证后,HLA-B27全部为阳性。通过对不同d值(荧光强度的均值与校准磁珠中位值的差值)范围样本的基因型分析设定判读规则,即d>2均判读为阳性,d≤-7为阴性,-7<d≤2为弱阳性(灰区),假阴性率和假阳性率均为0%,灰区样本HLA-B27检出率为80.6%。B27抗原荧光强度与HLA-B27的分型类别无关,而与带有HLA-B27的个数有关,灰区样本通常带有HLA-B7和HLA-B37基因型。结论实验室应拟定自己的HLA-B27阴阳性判断规则,在保证真阳性率的同时,降低假阴性率,并且将灰区范围尽量缩小。灰区样本通常具有特殊的HLA-B型别,可通过Flow-rSSO法来进一步检测,以提高HLA-B27的检出准确度。

湖南汉族人群HLA-DRB1位点等位基因多态性与鼻咽癌的相关性研究

目的 探讨湖南汉族人群HLA -DRB1位点基因多态性与鼻咽癌遗传易感性之间关系。 方法 用多聚酶链反应 -序列特异性寡核苷酸探针斑点杂交方法 ,对 93例湖南汉族鼻咽癌患者与 93例健康对照作HLA -DRB1位点基因分型 ,采用 χ2 检验比较两组各位点等位基因频率分布差异。 结果 鼻咽癌组DRB1 0 80 1较对照组高 (χ2 =4.2 2 ,P =0 .0 4 ,RR =1 .95) ,DRB1 1 1 0 1较对照组降低 (χ2 =5 .2 8,p =0 .0 2 ,RR =0 .33) ,但P值经Bonferoni校正后 ,差异无显著性(Pc >0 .0 5)。 结论 本研究结果未能证实HLA