源于类芽胞杆菌的低聚糖脱支酶底物特异性及其应用研究

脱支酶是淀粉深加工产业的常用酶制剂,然而传统脱支酶难以完全满足淀粉糖绿色生产及副产物综合利用的需求,因此有必要挖掘适合的新型脱支酶。本研究筛选并构建来源于类芽胞杆菌STB16的低聚糖脱支酶基因(oga)的枯草芽孢杆菌表达系统,实现低聚糖脱支酶的异源表达,并探究重组酶的酶学性质和底物特异性。结果表明,枯草芽孢杆菌发酵上清液的酶活力可达162.33 U/mL,重组酶的最适反应温度50℃、最适反应pH值6.0,且专一地作用于底物中聚合度为1的分支的α-1,6-糖苷键。相比于其它类型的脱支酶(底物转化率低于检出限),重组低聚糖脱支酶对异麦芽糖、异麦芽三糖、潘糖等异麦芽低聚糖具有更彻底的水解能力,底物转化率达97.4%~100%,且产物为葡萄糖,因此更适合用于处理葡萄糖母液,可使一次母液、二次母液和色谱分离尾液中葡萄糖含量分别提升3.6%,12.7%和34.4%。相关研究结果可为新型脱支酶的开发和利用奠定理论基础,也为淀粉糖加工副产物的综合利用提供重要参考。

玉米赤霉烯酮降解酶热稳定性及底物特异性改造策略

玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)及其衍生物是污染范围较大的真菌毒素,广泛存在于玉米、大麦、小麦和高粱等谷物及其副产品中,对饲料行业和畜牧养殖业造成严重的经济损失。利用生物技术对ZEN及其衍生物进行降解和脱除是未来解决ZEN污染的重要途径。然而,目前发现的ZEN降解酶热稳定性差,催化效率低,难以满足工业生产中高温、酸、碱等极端条件的需求。本文综述了近年来利用蛋白质工程提升ZEN降解酶热稳定性和底物特异性的改造策略,阐明ZEN降解酶改造的研究进展及存在问题,为开发ZEN降解酶的工程改造提供参考。

黑曲霉木聚糖酶的底物特异性和低聚木糖生产

对黑曲霉 (Aspergillusniger)木聚糖酶进行了纯化研究 ,结果表明 ,经SephadexG 1 0 0和DEAE SephadexA 5 0分离后 ,获得三个组分 ,称为X1、X2、X3。它们经PAGE电泳分析均为单一组分。对X1、X2、X3的相关性质 ,特别是底物特异性也作了研究。纯酶X3组分或部分纯化的酶可用于生产低聚木糖 ,产品得率为 1 0 %。

海因酶热稳定性及底物特异性研究进展

海因酶是在微生物中广泛分布的能水解5-取代海因衍生物制备光学纯氨基酸的关键生物催化剂,在各种氨基酸的酶法生产中具有良好的应用前景。着重概述了海因酶的热稳定性、底物特异性研究及应用,并讨论了其发展方向。

一株曲霉果糖转移酶酶学性质及底物特异性

一株野生曲霉(Aspergillussp.JN19)所产果糖转移酶为胞内酶,该酶的最适反应温度为50℃,在45～52℃范围内能够保持较高的酶活性;反应的最适pH为5.5,pH在4.0～6.0的范围内酶活力稳定;Mg2+对该酶具有激活作用,可以使酶活力提高2.2倍,Cu2+则完全抑制果糖转移酶活力;该酶能够催化蔗糖分子中的果糖基转移形成新的低聚糖;该酶具有广泛的受体特异性。

醛酮还原酶AKR7A5蛋白的纯化及其对萘醌类化合物的底物特异性研究

目的:探讨小鼠醛酮还原酶AKR7A5蛋白对萘醌及其衍生物的底物特异性。方法:IPTG(异丙基硫代半乳糖糖苷)诱导BL21pLysS大肠杆菌中His标签的AKR7A5融合蛋白大量表达,利用FPLC系统通过HiTrap亲和柱纯化His-AKR7A5融合蛋白,经SDS-PAGE和Western blot法鉴定纯化的AKR7A5蛋白。使用AKR酶活性实验检测纯化的重组AKR7A5蛋白对萘醌类化合物的底物特异性。结果:经SDS-PAGE和Western blot验证,成功纯化了His标签的AKR7A5融合蛋白;AKR酶活性实验结果显示,重组AKR7A5蛋白对散沫花醌有中等亲和力,对胡桃醌和维生素K3有较低的亲和力,对1,4-萘醌无亲和力。结论:成功纯化了重组AKR7A5蛋白,并检测了其对萘醌类化合物的底物特异性,结果表明醛酮还原酶很可能选择性地参与萘醌类化合物的代谢。

α-半乳糖苷酶水解底物的特异性及其在保育猪日粮中的应用

为研究α-半乳糖苷酶水解底物的特异性及日粮中添加与α-半乳糖苷酶(α-Gal)对保育猪生长的影响,进行了两个试验。试验一:1 mL浓度为1.0 mg/mL的蜜二糖、棉子糖和水苏糖分别与3 U的α-Gal于37℃孵育16 h,用离子色谱检测释放的α-D-半乳糖。结果表明,α-Gal可以水解95.7%的蜜二糖,72.5%的棉子糖以及32.9%的水苏糖。试验二:选用72头平均体重为(12.5±0.2)kg的仔猪为研究对象,分为2个处理,每个处理6个重复,每个重复6头猪,研究α-Gal对保育猪生长的影响。处理1为对照组,处理2在对照组的基础上添加300 U/kg的α-Gal。21 d试验结果表明,加酶组平均日增重641 g,比不加酶组提高了9.8%(P=0.015);与对照组相比,加酶组饲料转化率提高了10.1%(P=0.020);两组之间平均日采食量差异不显著(P=0.944)。总之,α-Gal可以有效地降解棉子糖类寡糖,保育猪玉米-豆粕基础日粮中添加300 U/kgα-Gal显著提高了平均日增重和饲料转化率。

脂肪酶的底物特异性及其应用潜力

不同来源的Ｌｉｐａｓｅ对底物油脂中脂肪酸的链长、不饱和度及不饱和脂肪酸的双键位置表现出不同的脂肪酸特异性；对甘油酯中Ｓｎ－１（３）和Ｓｎ－２位酯键具有不同的位置特异性；对甘油酯中立体对映结构的１位和３位酯键呈现不同的立体特异性，脂肪酶能够催化酯水解和酯合成（或酯交换）反应，用于制备甘油单酯、多不饱和脂肪酸及其酯和具有光学活性的有机化合物，因此它在油酯加工和有机合成中具有很大的应用潜力。

甘蓝型油菜脂肪酸碳链延长酶BnaA.FAE1与BnaC.FAE1的底物特异性分析

研究脂肪酸碳链延长酶(FAE1)的底物特异性,旨在为改良油料种子脂肪酸提供信息,将甘蓝型油菜A、C基因组的BnaA. FAE1和BnaC. FAE1分别在亚麻荠种子中表达。其转基因种子中,山嵛酸与芥酸含量的比值(C22∶0/C22∶1)分别为0. 18和0. 88,表明BnaA. FAE1对单不饱和脂肪酸亲和力较高,而BnaC. FAE1则对饱和脂肪酸亲和力较高,这种差异在各转基因世代表现稳定。通过分析T3转基因家系种子中酰基辅酶A(Acyl-Co As)的组成,进一步证明了上述结论。但是在拟南芥中分别异源表达上述基因,并没有观察到类似的底物特异性差异。在甘蓝型油菜祖先种,白菜型油菜和甘蓝种子中调查其C22∶0/C22∶1比值,同样未发现其FAE1底物特异性存在差异。综上认为BnaA. FAE1和BnaC. FAE1在亚麻荠中存在底物特异性。

α-半乳糖苷酶的催化机理及底物特异性

α-半乳糖苷酶属外切糖苷酶类,普遍存在于动、植物及微生物中,在食品、饲料、医药、造纸等领域应用广泛。论述了α-半乳糖苷酶的催化机理、底物特异性方面的研究进展,并讨论了其在食品工业中的应用及发展前景。

分枝犁头霉α-半乳糖苷酶的底物特异性

α-半乳糖苷酶作用于棉子糖后产物为半乳糖和蔗糖,作用于蜜二糖后产物为半乳糖和葡萄糖。对蜜二糖,棉子糖及水苏四糖的水解速率顺序为:蜜二糖(82.2%)>水苏四糖(13.7%)>棉子糖(7.5%)。对于酶的不同底物pNpGal、蜜二糖、棉子糖及α-甲基-D-半乳糖苷,其K_m值分别为0.29、5.0、79.4及55.5mmol/L,V_(max)值分别为1.43、0.23、0.21及0.16μmol·min^(-1)·ml^(-1)。测定了43种碳水化合物对酶活力的影响。其中半乳糖、甘油醛及纤维二糖使酶活力下降50%以上,D-阿拉伯糖、塔格糖、半乳糖醛酸、D-核糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖酸内酯,乳糖及蔗糖使酶活下降到70%左右;而二羟丙酮、2-脱氧-D-半乳糖及异丙基β-D-硫代半乳糖苷使酶活提高50%左右;其余的碳水化合物对酶活无明显影响。测定了Hg^(2+)、甘油醛及半乳糖对酶的抑制类型。结果表明,Hg^(2+)是α-半乳糖苷酶的非竞争性抑制剂,半乳糖及甘油醛是酶的竞争性抑制剂,后两者的K_i值分别为8.3及12.5mmol/L。

蛋白酶底物特异性改变对白鲢鱼肉蛋白酶解效率和产物抗氧化性的影响

通过对比水产品加工蛋白酶及其底物特异性位点突变酶E156S、E156N和E156D对白鲢鱼肉蛋白水解能力及其酶解产物抗氧化性的差异,探讨底物特异性改变对酶的酶解效率和产物活性的影响.结果表明,突变酶E156D的终水解度最高(15.22%),其次为E156S(13.60%),远高于E156N与原酶的9.37%.原酶和突变酶E156S酶解白鲢鱼肉产物的抗氧化性无明显差异,分别为83.79%和84.05%.而突变酶E156N酶解白鲢鱼肉产物的抗氧化性为76.6%;E156D酶解白鲢鱼肉产物的抗氧化性最低(50.05%).说明枯草蛋白酶BPN底物特异性相关的156位点突变对蛋白酶水解鲢鱼蛋白能力和产物活性都具有重要影响.

定向进化改造猪肾氨基酰化酶Ⅰ底物特异性

应用定向进化技术提高了猪肾氨基酰化酶I(pACY1)对乙酰-L-精氨酸和乙酰-L-苯丙氨酸的底物特异性和热稳定性。结合易错PCR和DNA改组的方法,构建了pACY1的突变体文库;利用营养选择平板和96孔板耐热双重筛选体系。经过5轮改组和筛选,得到突变酶7E15对乙酰-L-精氨酸和乙酰-L-苯丙氨酸的特异性活力分别提高了23倍和9倍,Tm值提高了7℃。突变酶的氨基酸序列中有7个氨基酸残基发生了替换,分别是L176A、R196T、A283G、V304G、K306Q、V369A和L370T。结构模拟结果显示,突变位点L176A、V369A和L370T靠近酶活性中心,影响了底物的结合;而R196T、A283G、V304G和K306Q离酶活性中心较远,可能对酶的热稳定性起到了关键作用。

环状芽孢杆菌β-半乳糖苷酶水解乳糖和ONPG的底物特异性(英文)

在细菌乳糖酶的菌株筛选过程中发现 ,OHA与LHA的比值范围在 1.3～ 32 .2之间 ,表明OHA与LHA差异很大 ,无相关性 .对环状芽孢杆菌的乳糖酶研究发现 ,Na+和K+能不同程度地促进OHA和LHA ;Mg2 +能增强OHA ,对LHA却表现出抑制作用 .酶作用于ONPG和乳糖的最适 pH和温度也存在差异 .一定反应体系中 ,OHA/LHA的值随反应条件的变化而不同 ,因此用OHA来评价LHA会对酶的实际应用带来很大影响 .

小鼠3种α1,2岩藻糖转移酶的底物特异性

目的对比小鼠3种GDP岩藻糖O!半乳糖苷"112-岩藻糖转移酶("112-FT)的底物特异性。方法利用RT-PCR方法克隆小鼠3种"112-FT基因编码区MFUT-Ⅰ、MFUT-Ⅱ、MFUT-Ⅲ,测序后分别将其插入表达载体pcDNA3.1的多克隆位点,构建表达载体pcDNA3.1-MFUT-Ⅰ、pcDNA3.1-MFUT-Ⅱ及pcDNA3.1-MFUT-Ⅲ;采用磷酸钙法将其转染于COS-7细胞进行表达,通过检测3种酶对不同种底物特性比较酶的特异性。结果小鼠基因MFUT-Ⅰ、MFUT-Ⅱ、MFUT-Ⅲ分别与人类H基因(77%)、Se基因(79%)和Sec1基因(75%)具有序列同源性。MFUT-Ⅰ和MFUT-Ⅱ基因转染后的COS-7细胞均具有"112-FT活性1而MFUT-Ⅲ基因转染的COS-7细胞无此活性。MFUT-Ⅱ同时对底物缺乏唾液酸的神经节苷脂(GA1)及单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)存在活性1分别生成产物岩藻糖基化GA1(FGA1)及岩藻糖基化神经节苷脂GM1(FGM1)<而MFUT-Ⅰ仅对底物GA1存在活性。MFUT-Ⅱ对GA1的比活性约为MFUT-Ⅰ的80～90倍。MFUT-Ⅱ对GA1的比活性为GM1的10￣20倍。MFUT-Ⅱ不仅具有合成Ⅳ型H抗原FGA1及FGM1活性,同时具有对乳丁糖神经酰胺(Lc4Cer)及异乳丁糖神经酰胺(nLc4Cer)的活性,可合成Ⅰ型及Ⅱ型H抗原。结论MFUT-Ⅱ是小鼠的主要"112-FT,具有合成Ⅳ型H抗原FGA1及FGM1的功能;MFUT-I仅有合成Ⅳ型H抗原FGA1的功能;MFUT-Ⅲ无"112-FT活性。

蚯蚓纤溶酶底物特异性

蚯蚓纤溶酶是具有较强溶栓作用的丝氨酸蛋白酶,为研究蚯蚓纤溶酶在溶栓的同时是否对其他血液蛋白有破坏作用,本实验以一些血液功能蛋白为底物,用蚯蚓纤溶酶在体外对其进行水解,采用SDS-PAGE检测水解前后底物成分的变化。结果显示,蚯蚓纤溶酶短时间内能完全水解纤维蛋白和纤维蛋白原,长时间作用下能部分水解牛血清白蛋白和人免疫球蛋白重链,不水解牛血红蛋白、牛血超氧化物歧化酶和牛凝血酶原。表明蚯蚓纤溶酶对血栓成分具有较强的识别和水解能力,而对其他血液蛋白作用微弱,说明蚯蚓纤溶酶作为药物使用时具有较强的溶栓和预防血栓形成的作用,且副作用较小。

底物特异性的生物催化与酶设计改造

随着生物产业的发展,生物酶催化发挥着越来越重要的作用。然而,部分酶在应用过程中仍然存在诸多问题,影响了生物催化的进一步发展。本文以酶的底物特异性为切入点,回顾了酶的专一性、高效性和环保性;介绍了酶在药物合成和天然产物改性领域的应用以及所遇到的问题;综述了酶的底物特异性改造过程中各种方法的应用,包括化学修饰、非理性和理性设计。化学修饰作为一种直观的修饰方法,通过化学反应对酶分子进行改造;非理性设计是利用易错PCR和DNA Shuffling等手段获得底物特异性提高的突变体;理性设计是基于序列和结构信息对酶分子进行改造。本文从重塑活性口袋提高酶的底物特异性和重塑活性口袋改变酶促反应类型两个方面出发,详述了理性设计改变酶的底物特异性的方法,为酶的特异性改造提供借鉴。

裂殖壶菌脂肪酶基因克隆及底物特异性研究

裂殖壶菌甘油三酯合成和水解的过程中,脂肪酶起着重要的作用。根据同源性分析结果,筛选得到裂殖壶菌脂肪酶基因STGL2。以cDNA为模板获得STGL2脂肪酶基因,将其连接到pPIC9K载体上,得到重组质粒pPIC9K-STGL2,并在毕赤酵母中表达;系统分析了重组脂肪酶(Stgl2p)的底物特异性。结果表明:STGL2脂肪酶基因在毕赤酵母中成功表达;裂殖壶菌脂肪酶Stgl2p的最适底物为对硝基苯酚月桂酸酯(p-NPL),其最适p H为7.5,最适反应温度为35℃。综上所述,脂肪酶Stgl2p在裂殖壶菌细胞内对甘油三酯中长碳链脂肪酸的水解起着重要的作用。

变幻青霉氨基甲酸乙酯降解酶产酶条件优化及酶的底物特异性

在单因素优化基础上,运用正交试验设计理论,优化氨基甲酸乙酯降解酶产生菌P.variabile JN-A525的产酶条件。优化发酵培养基配方为:葡萄糖20 g/L,牛肉膏10 g/L,KH2PO45g/L、NaCl 1 g/L、KCl 5 g/L;发酵条件为:初始pH 6.0、培养温度32℃、接种体积分数3%、250 mL摇瓶装量70 mL、摇床转速100 r/min,在此优化条件下酶活比优化前提高了3.47倍。对经超声破碎、(Na)2SO4盐析、Superdex G-75凝胶过滤层析步骤初步纯化的酶之底物特异性的研究表明,在模拟黄酒体系下,该酶对尿素和氨基甲酸乙酯有相对强的降解作用,对一些酯类和氨基酸没有降解作用。

重组氨肽酶底物特异性及协同水解玉米蛋白质

以9种不同的氨基酸一对硝基苯胺为底物，考察重组枯草芽孢杆菌氨肽酶对底物的特异性。结果显示，该氨肽酶对由疏水氨基酸组成的Leu-pNA水解活力最强。其次是两种由碱性氨基酸组成的Arg-pNA、Lys-pNA，对其它几种由疏水氨基酸组成的Ala—pNA、Ile-pNA、Val-pNA、Phe-pNA、Pro-pNA表现出较弱的水解活力．而对酸性氨基酸组成的Glu-pNA则无水解活力。在此基础上考察其与内切蛋白酶协同水解玉米蛋白质的效果。以水解度为指标进行单因素试验，明确氨肽酶与碱性蛋白酶复配水解玉米蛋白质的效果较佳。双酶水解产物中新增游离氨基酸含量分别为碱性蛋白酶和氨肽酶单独水解的4．89倍、6．05倍；水解产物中多肽相对分子质量多在1000Da以下，其中500～1000Da的寡肽占14．57％。180～500Da的小肽质量分数为68．42％，水解度达65％。这些结果表明,氨肽酶和碱性蛋白酶协同水解蛋白质原料具有良好的应用前景。