金嗓清音丸中僵蚕成分的特异性引物扩增鉴定

目的建立特异性引物扩增鉴定金嗓清音丸中僵蚕成分。方法根据家蚕、白僵菌、绿僵菌线粒体全基因序列差异设计特异性引物PM2、PB2、PA2,采用十六烷基三甲基溴化铵法、酚仿抽提法提取纯化总DNA,并以此为模板进行特异性引物扩增和方法学考察,产物以2%琼脂糖凝胶电泳检测。结果家蚕、白僵菌、绿僵菌DNA经PCR扩增后,分别在82、94、144 bp处产生条带,并且未观察到非特异性扩增条带。PM2、PB2、PA2对相应DNA的检测灵敏度分别为0.10、0.10、0.010 ng/μL。来自同一厂家的6批样品中同时检出家蚕、白僵菌DNA,但未检出绿僵菌DNA,而另外2批样品仅检出家蚕DNA。结论该方法方便可靠,专属性强,有助于更好地监控金嗓清音丸等含僵蚕中药成方制剂的质量,可为其临床用药的安全性和有效性提供保障,并为其他中成药中动物药的专属性鉴定提供参考。

基于特异性引物高效构建TALE文库

人工构建的转录激活因子样效应物(TALE)已广泛应用于基因转录调控和基因组编辑领域,针对TALE构建过程非常复杂,研发了一种构建TALE文库的新方法。首先,基于金门酶切连接方法,设计3种用于识别碱基G的TALE骨架质粒;其次,使用4种特异性引物扩增3种骨架质粒得到质粒突变体;最后,使用金门酶切连接方法连接3种质粒突变体,成功构建最终的TALE文库。基因测序结果表明该文库包含所有可能确定TALE-DNA结合特异性的核苷酸组。由于TALE的高靶向性和多功能性,该TALE文库将广泛用于生命科学领域。

石斛属RAPD分析及鉴定铁皮石斛的特异性引物设计

目的 :对石斛属植物亲缘关系进行分析 ,并设计一对能方便准确地鉴别铁皮石斛的特异性引物。方法 :用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对石斛属内 2 6个种和金石斛属的 1个种进行了基因组DNA多态性分析 ,并构建聚类树状图。根据筛选到的DNA片段序列 ,将Sangon18引物从 3’端延长至 2 0bp ,得到所要的特异性引物。结果和结论 :设计成的特异性引物能方便快捷地鉴别出铁皮石斛。此技术为药材的分子鉴定提供了一个新思路。

型特异性引物PCR研究HBV基因型与临床表现的关系

目的 :研究乙肝病毒 (HBV)基因型与临床表现的关系。方法 :收集湖南省慢性携带、慢性轻度、慢性中度、慢性重度和慢性重型等 5种临床类型的慢性乙肝病人的血清 2 2 0例 ,采用型特异性引物进行巢式PCR ,对血清中的HBV进行基因分型 ,比较不同基因型的临床资料。结果 :发现B ,C两种基因型 ,比例分别为 86 .4 %和 13.6 %。随着病情加重 ,基因C型的比例增加 (P <0 .0 5 )。C型的谷丙转氨酶 (ALT)、总胆红素 (TBIL)、HBV DNA等平均水平均较B型高 ,但无统计学意义。C型的ALT升高率 (96 .7% )显著高于B型 (75 .2 % ) (P <0 .0 5 )。B ,C两型的HBeAg阳性率总体无差别 ,但在慢性重型以及 2 130岁年龄段的患者中 ,C型的HBeAg阳性率 (35 .0 %和 5 0 .0 % )均显著高于B型 (14 .4 %和 2 4 .5 % ) (均P <0 .0 5 )。结论 :湖南省HBV基因型以B ,C型为主 ,基因型与临床表现有相关性 。

等位基因特异性引物PCR技术及其应用研究

目的 :研究建立等位基因特异性引物PCR技术体系 ,并将其应用于基因单核苷酸多态性研究工作。方法 :通过美国国家生物信息中心 (NCBI)的genBank获取基因序列及其相应位点的SNP信息。利用Primer5 .0软件设计引物 ,并经NCBI的Blast2 .0软件检验其特异性。结果 :建立了单一等位基因特异性引物PCR(SASP -PCR)与嵌套式等位基因特异性引物PCR(NASP—PCR)两种技术 ,并应用于 β2 肾上腺素受体及内皮源性一氧化氮合酶基因单核苷酸多态性的研究 ,证实该技术的稳定性和优越性。结论 :等位基因特异性引物PCR技术是一种更为简便、特异性较高、费用少的、便于推广的SNP检测方法 。

人工修饰双等位基因特异性引物扩增法检测CYP1B1多态性与肺癌易感性的关系

[目的 ]应用一种新的快速检测单核苷酸多态性 (SNP)方法———人工修饰双等位基因特异性引物扩增 (di ASA AMP)法研究CYP1B1基因Leu43 2Val位点多态性与江苏汉族人群肺癌易感性的关系。 [方法 ]采用配对病例 对照研究 ,收集江苏汉族人群原发性肺癌患者 2 2 7例为病例组 ,同时按 1∶1配对选择非肿瘤、非呼吸道疾病患者 2 2 7例为对照组。应用diASA AMP方法检测了病例组与对照组CYP1B1基因Leu43 2Val位点多态性 ,分析Leu43 2Val位点突变与肺癌易感性之间的关系。并应用测序法验证diASA AMP法的特异性。 [结果 ]CYP1B1基因Leu43 2Val位点突变C和G的基因频率在对照组和病例组的分布差异无显著性 ( χ2 =0 .2 0 1,P >0 .0 5 ) ,单纯CYP1B1基因Leu43 2Val位点突变与肺癌危险性也不存在明显的相关关系 (OR =1.0 85 ,95 %CI =0 .73 0～ 1.615 ) ,但该位点突变与吸烟可能有一定协同作用 ,携带G等位基因的基因型可增加吸烟者患肺癌的危险性 (OR =2 .0 5 7,95 %CI =1.162～ 3 .64 2 )。对照组的CYP1B1C和G等位基因频率与现有的中国汉族人群资料结果相近 ,测序结果与diASA AMP结果相符。 [结论 ]CYP1B1Leu43 2Val多态性可能是江苏汉族人群吸烟者肺癌发生的易感因素。diASA

3种鹿类动物物种特异性引物的设计及其有效性

近些年来，市场上出现了很多来自国外的驯鹿(Rangifer tarandus)茸和驼鹿(Alces alces)茸的切片，被当作梅花鹿茸出售；马鹿(Cervus elaphus)和梅花鹿(C.Nippon)的肉、内脏、胎盘、阴茎等产品也经常被其他动物的相应产品所冒充。……

利用甲基化特异性引物高通量检测DNA甲基化

建立一种基于甲基化特异性引物和SAGE技术的高通量DNA甲基化定量检测新方法(MSP-SAGE),首先利用亚硫酸氢钠对基因组DNA进行处理,使未甲基化的C转变为U,而甲基化的CpG不变.将处理和未处理的DNA双链变性后用随机引物PNNNNCG对存在含有CG的单链进行延伸,而无甲基化CG的单链处则不能延伸;将差异延伸的单链序列和频次信息经过系列分子操作后,引入PCR扩增模板;对中间带有未知序列的PCR扩增产物进行串连克隆测序.将来自于未处理组和处理组的某一CpG位点的序列出现的次数定义为[Tags]A和[Tags]B,将标准系列的实际甲基化水平和[Tags]B/[Tags]A之间建立线性回归方程.根据每一CpG位点的[Tags]B/[Tags]A比值可反推该位点的甲基化水平.MSP-SAGE具有良好的线性,基于标准系列的[Tags]B/[Tags]A与其实际甲基化水平的标准曲线方程为y=1.455x(R2=0.984,P<0.01).MSP-SAGE的回收率在95%到110%之间,精确度位于4.2%和10.5%,检测限在3%左右,单次检测通量可达24个CpG位点.MSP-SAGE是一种很有应用前途的高通量DNA甲基化定量检测方法.

应用位点特异性引物鉴定白花蛇舌草

目的 :建立一种简便实用的白花蛇舌草药材的DNA分子鉴定方法。方法 :收集目前市场上出现的白花蛇舌草及伪品共 9种 ,分别提取总DNA ,扩增rDNAITS 2区序列 ,对比所有样品的该段核苷酸序列 ,并设计能专一性鉴别白花蛇舌草的位点特异性引物。结果 :白花蛇舌草及其混淆品在ITS 2区的序列有显著差异。用位点特异性引物对所有样品DNA进行PCR扩增 ,只有白花蛇舌草有明显的约 392bp扩增产物 ,而其它 8种植物在同等条件下无阳性产物。结论 :所设计的鉴别引物对白花蛇舌草有高度的特异性。

多对型特异性引物巢式PCR检测湖南省乙肝病毒基因型

目的:采用多对型特异性引物,通过巢式PCR法检测湖南省乙肝患者血清中乙型肝炎病毒(HBV)基因型的分布情况.方法:根据从前S1基因到S基因中的保守序列设计出10条内外引物,并将其中8条内引物分成A、B两组,分别扩增A、B、C和D、E、F型HBV,然后将第2轮PCR的两组产物分别用3%琼脂糖进行电泳,根据PCR产物片断大小直接判定HBV基因型.与目前常用的PCR-RFLP法进行了比较,并做重复试验以证实该方法的可靠性和准确性.用此法检测了220例湖南籍慢性乙肝血清中的HBV基因型,以了解湖南人群的HBV基因型分布情况.结果:多对型特异性引物巢式PCR与PCR-RFLP法的检测结果完全一致,重现率(100%);湖南人群HBV基因分型结果为B型190例(86.4%)、C型30例(13.6%).结论:这种新的巢式PCR分型法能清晰直观地辨别HBV基因型,结果准确可靠.用此法证实了湖南人群的HBV优势基因型以B型为主,C型次之.

烟草青枯菌特异性引物筛选及其应用

为解决快速诊断烟田土壤中是否含有烟草青枯菌这一问题,基于已公布的5个青枯菌基因组全基因组比对结果,设计9对青枯菌特异性引物,筛选并验证得到3对引物能对青枯菌进行特异性扩增。应用筛选得到的引物能对土壤中烟草青枯菌进行特异性检测,初步认为本方法对土壤青枯菌最低检出率为2×106/g,为土壤中快速检测烟草青枯菌提供了快速、准确诊断的新方法。

特异性引物PCR鉴定鸡球虫种类与卵囊纯度的研究

为了建立鸡球虫种类的快速分子生物学鉴定方法,检测实验室保存虫株受污染状况,分别对单卵囊分离繁殖及实验室长期传代保存的6株巨型艾美耳球虫（EMSH01、EM4101、EMES01、EMBA01、EMTY01和EMTO01）、4株柔嫩艾美耳球虫（ETDS01、ETGD01、ETAD和ETAM）、1株堆形艾美耳球虫（EA1201）、1株变位艾美耳球虫（EMIS01）、1株毒害艾美耳球虫（ENGD01）收集卵囊,纯化、提取总DNA,根据巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫、堆形艾美耳球虫的RAPD和SCAR分子标记、ITS-1区序列分别设计Tn-F与Tn-R、Mx-F与Mx-R、Ac-F与Ac-R、ET-1与ET-2、EM-1与EM-2、EA-1与EA-2等6对特异性引物,对13个虫株分别进行PCR扩增,1%琼脂糖电泳分析片段大小.结果显示：用引物Tn-F与Tn-R、ET-1与ET-2对ETDS01、ETGD01、ETAD、ETAM、EMTO01扩增出特异性条带,其余4种8个虫株未见条带;用引物Mx-F与Mx-R、EM-1与EM-2对EMSH01、EM4101、EMES01、EMBA01、EMTY01和EMTO01扩增出特异性条带,其余4种7个虫株未见条带;用引物Ac-F与Ac-R、EA-1与EA-2对EA1201扩增出特异性条带,其余4种12个虫株未见条带.结果说明特异性引物PCR方法鉴定的5种球虫与原常规生物学方法鉴定的结果一致,检测出保存的巨型艾美耳球虫EMTO01虫株受柔嫩艾美耳球虫污染,其余虫株未发现交叉污染.研究证明利用特异性引物建立的PCR方法可用于鸡球虫种类与卵囊纯度的鉴定.

药材天麻ITS2特异性引物的筛选

目的:药材天麻由于隶属于单子叶植物兰科天麻属,天麻中含有大量多糖、蛋白质以及大量次生代谢物质,使其提取的DNA质量不高,影响后续的PCR扩增。且ITS2通用引物在单子叶植物部分物种通用性很差。本研究通过对DNA提取过程、PCR扩增过程进行优化,设计出一对用于鉴别天麻药材的ITS2引物,为中药材天麻的鉴定提供一种新方法。方法:以通用ITS2引物扩增出的两条序列为研究对象,经Primer Premier 5.0设计出3对特异性引物,通过对22份样品进行研究,筛选出一条高特异性的ITS2引物。结果:在54℃的退火温度下,TM2F-2R对天麻的鉴定效率高达90.9%。结论:TM2F-2R可作为天麻ITS2序列的特异性引物,为天麻的分子鉴定提供了一套准确、稳定的鉴定方法。

等位基因特异性引物和TaqMan-MGB探针双抑制野生等位基因扩增的实时荧光定量PCR检测JAK2V617F突变率

本研究建立在外周血基因组DNA中定量检测JAK2V617F突变率的荧光定量PCR检测方法并探讨其临床应用价值。在实时荧光定量PCR分析系统中,应用等位基因突变引物和等位基因野生TaqMan-MGB探针共同抑制JAK2V617F野生等位基因扩增,从而特异性地扩增JAK2V617F突变等位基因。通过测定不同JAK2V617F突变率标准品及其循环阈值(Ct值),建立JAK2V617F突变率定量测定方法,并对89例表观健康人外周血基因组DNA中JAK2V617F突变率进行检测。结果表明,建立的方法定量检测JAK2V617F突变率的下限为0.1%,检测JAK2V617F突变率的批内、批间平均变异率分别为4.1%和6.1%。对89例表观健康人外周血基因组DNA中JAK2V617F突变率检测显示,其中2例为JAK2V617F阳性,突变率分别为0.64%和0.98%。结论:建立的JAK2V617F突变率定量检测方法具有检测灵敏度高和重复性好的特性,适合骨髓增殖性疾病的诊断及疾病进程和疗效监测。本方法检测原理可用于各种单碱基突变率的检测,具有广泛的应用前景。

序列特异性引物联合RT-PCR在LRRK2基因多态性分型中的应用

目的建立帕金森病(PD)相关基因LRRK2疾病易感位点R1628P、G2385R的新检测方法。方法设计序列特异性引物,采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)的方法,对已知基因型的标准品进行分型检验;检测100例未知基因型的PD样品,并用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RLFP)的方法对待检样品基因型进行验证。结果标准品分型结果完全正确,待检的100例样品分型结果与PCR-RLFP分型结果完全吻合。结论序列特异性引物联合实时荧光定量PCR可成功实现对LRRK2疾病易感位点R1628P、G2385R的基因型分型。

建立序列特异性引物PCR检测儿茶酚胺氧位转移酶与单胺氧化酶基因多态性的方法

目的建立用PCR-SSP检测儿茶酚胺氧位转移酶(COMT)与单胺氧化酶(MAOA)的基因多态性的方法。方法根据COMT与MAOA的基因序列,采用针对变异位点的点突变方式设计出顺序特异性引物(SSP)进行PCR扩增,并借助常规电泳确定基因型。结果用PCR-SSP来研究COMT与MAOA基因多态性的方法特异性强,重复性好,而且简便、经济、快速。结论PCR-SSP可对具有单核苷酸突变的基因分型,应用前景良好。

序列特异性引物PCR法检测MN血型基因型

目的 建立MN血型系统基因分型的方法 ,检测人群中MN基因的频率。方法 用快速盐析法抽提样本DNA ,序列特异性引物PCR法检测MN基因。结果 115例汉族人群中MM基因型为 2 5例 ,MN基因型为 6 0例 ,NN基因型为 30例。M基因频率为 0 .4 78,N基因频率为 0 .5 2 2。结论 该方法可以检测MN血型基因型。

涅斯捷连科氏菌特异性引物PCR分子鉴定(英文)

涅斯捷连科氏菌属的建立基于对 Micrococcus halobius 的再分类,这是一类广泛分布于高盐土壤环境的革兰氏阳性细菌,属放线菌类。在对我国西部盐湖环境放线菌的生物多样性及分类学研究中,大量类似菌株被分离。【目的】为了对其进行快速鉴定,特别是筛选出属于优势类群的涅斯捷连科氏菌,【方法】本研究根据前人以报道的方法设计了一对针对其16S rRNA 基因的特异性PCR 引物(Nes1/Nes2),【结果】并通过部分典型菌和野生菌株的PCR实验验证,结合16S rRNA基因的测序验证,证明了Nes1/Nes2 的 PCR 反应有效性及其对涅斯捷连科氏菌的特异性。【结论】利用该引物可以快速准确的对涅斯捷连科氏菌进行鉴定。

序列特异性引物多聚酶链反应方法进行大样本多基因的多态性鉴定(英文)

目的建立多个基因同时进行多态性分析的序列特异性引物多聚酶链反应(PCR-SSP)方法,以满足其在临床检验中进行基因多态性鉴定时的应用。方法应用优化后的PCR-SSP的方法分析以下基因的多态性:TNF-α-308A/G和-238G/A变异、IL-6-174G/C变异、CYP2D6*10B外显子第188位的C/T变异。结果应用同一个PCR扩增程序,可同时对多个基因、多个临床样本的基因多态性同时进行分析,基因型清晰,而且基因分型快速、准确。结论优化后的PCR-SSP适合对大样本、多个基因的单核苷酸位点变异进行多态性分析,值得在临床检验的应用中推广。

人工修饰双等位基因特异性引物结合SYBR Green Ⅰ荧光PCR法检测GSTP1基因多态性

目的建立人工修饰双等位基因特异性引物结合SYBR Green Ⅰ荧光PCR法检测GSTP1第105个密码子基因多态性的方法,并利用该法研究GSTP1第105个密码子在广西百色市人群遗传特征,为进一步研究GSTP1基因多态性与疾病的发生易感性研究奠定基础。方法采用人工修饰双等位基因特异性引物结合SYBR Green Ⅰ荧光PCR法技术对211例广西百色市健康成人进行GSTP1 Ile105Val基因分型,并分析是否存在性别差异及与国内外其他人群分布频率差异。结果人工修饰双等位基因特异性引物结合SYBR Green Ⅰ荧光PCR法GSTP1基因型检测结果与PCR产物测序结果一致,用此法检测出广西百色市女性和男性人群GSTP1 Ile105Val均以A等位基因为主,分别为79.7%和84.5%;AA野生纯合子型、AG杂合子型和GG突变纯合型在女性人群中分别为62.2%、35.1%和2.7%,男性人群则为71.0%、27.0%和2.0%。经统计学分析,广西GSTP1Ile105Val等位基因和基因型分布频率无性别差异,与辽宁、回族、印度、俄罗斯族等人群相应位点基因型分布频率无差异,但与国内维族、朝鲜族、蒙古族、高加索女性相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论人工修饰双等位基因特异性引物结合SYBR Green Ⅰ荧光PCR法是一种快捷、准确的基因多态性检测方法。广西人群GSTP1基因Ile105Val呈多态性分布,基因型分布频率无性别差异,与其他部分种族存在差异。