金嗓清音丸中僵蚕成分的特异性引物扩增鉴定

目的建立特异性引物扩增鉴定金嗓清音丸中僵蚕成分。方法根据家蚕、白僵菌、绿僵菌线粒体全基因序列差异设计特异性引物PM2、PB2、PA2,采用十六烷基三甲基溴化铵法、酚仿抽提法提取纯化总DNA,并以此为模板进行特异性引物扩增和方法学考察,产物以2%琼脂糖凝胶电泳检测。结果家蚕、白僵菌、绿僵菌DNA经PCR扩增后,分别在82、94、144 bp处产生条带,并且未观察到非特异性扩增条带。PM2、PB2、PA2对相应DNA的检测灵敏度分别为0.10、0.10、0.010 ng/μL。来自同一厂家的6批样品中同时检出家蚕、白僵菌DNA,但未检出绿僵菌DNA,而另外2批样品仅检出家蚕DNA。结论该方法方便可靠,专属性强,有助于更好地监控金嗓清音丸等含僵蚕中药成方制剂的质量,可为其临床用药的安全性和有效性提供保障,并为其他中成药中动物药的专属性鉴定提供参考。

多重特异性引物扩增技术鉴定小儿肺咳颗粒中鸡内金成分

建立多重PCR分子技术鉴定小儿肺咳颗粒中鸡内金真伪的方法。方法 采用甲醇预沉淀与CTAB结合法提取DNA,根据家鸡、麻鸭、家鹅的线粒体基因序列设计和筛选引物,建立基于特异性引物检测鸡内金的多重PCR方法,并进行方法学考察,用于市售小儿肺咳颗粒中鸡内金的真伪鉴别。结果 筛选得到的鸡、鸭、鹅内金DNA分别在94 bp,123 bp和155 bp处产生清晰明亮条带且未发现非特异性扩增,引物最佳组合浓度PGD: PAP: PAA为0.28: 0.16: 0.08 μM,PCR循环33次得到的条带清晰且无非特异性扩增,该方法特异性良好,灵敏度达1 ng/μL,该方法检测不同厂家10个批次小儿肺咳颗粒样品,发现1个批次检出有鹅内金掺伪,检出率为10.0%。结论 多重PCR分子技术鉴定方法可以很好地监控含鸡内金成方制剂的质量。

人工修饰双等位基因特异性引物扩增法测定人ABC1基因突变点I823M

目的 建立一种简单、快速测定三磷酸腺苷结合盒转运子 1(ATP binding- cassettetransporter 1,ABC1)基因突变点 I82 3M的方法。方法 设计两种等位基因特异性引物 ,分别与 DNA双链的两条单链互补 ,其 3′端正好与单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism ,SNP)位点重合 ,由引物的 3′端控制着引物的延伸反应 ,根据延伸反应的长度确定等位基因的类型 ,并通过在引物的 3′端区域引入一个人为不匹配碱基来提高延伸反应的特异性。结果 人为引入错配碱能提高单核苷酸多态性分析的特异性 ;通过优化实验条件 ,用本室建立的双等位基因特异性扩增法 ,可测定人 ABCA1基因突变点 I82 3M的不同 SNP类型。结论 人工修饰双等位基因特异性引物扩增法可用于人基因组中单核苷酸多态性的快速测定 ,不需使用复杂仪器设备 ,便于推广使用。

浙江省绍兴市茄子黄萎病菌菌株致病型鉴定及其生物学特性研究

用大丽轮枝菌(Verticillium dahlida)落叶和非落叶致病型菌株特异性引物扩增,鉴定了浙江省绍兴市茄子黄萎病菌菌株的致病型,并研究了其生物学特性。特异性引物的聚合酶链式反应扩增结果表明,来自浙江省绍兴市的5个代表性分离菌株(VD-sy1、VD-sy2、VD-sy3、VD-sy4和VD-sy5)均属于落叶型菌株。生物学特性研究结果表明,菌株VD-sy1菌丝生长的最适条件为温度25℃,24 h黑暗,有较宽的酸碱度范围(pH 4.0～9.0);在以蔗糖为碳源和以酵母膏为氮源的培养基上菌丝生长较快,线性生长率分别为4.25和4.06 mm·d^(-1);在以半乳糖为碳源和以氯化铵为氮源的培养基上生长较慢,线性生长率分别为2.24和2.42 mm·d^(-1)。

PCR-SSP／PCR-SBT-HLA高分辨等位基因分型比较

【目的】为了预测无关捐献者干细胞移植(HSCT)后GVHD的发生及程度和选择相容的干细胞捐献者,通过同时采用PCR-序列特异性引物扩增技术(sequence specific primer,PCR-SSP)和PCR-直接碱基序列分析基因分型技术(sequence based genotyping,PCR-SBT)的方法,提高HLA基因分型的准确性和分辨水平。【方法】采用PCR-SSP和PCR-SBT分别对57份捐献者血样进行HLA-A、B和DRB1位点的高分辨等位基因分型(即识别基因的编码达到*后4位数)。【结果】PCR-SBT实验中有27份DNA的基因分析结果模棱两可,PCR-SSP实验中有10份DNA的基因分析结果模棱两可。经两种方法相互佐证实验后,57份样本均获得结果一致、清楚和精确的HLA-A、B、DRB1位点高分辨基因分型。【结论】PCR-SSP和PCR- SBT是HLA高分辨基因分析的标准方法,两种方法具有实验互补意义,若同时应用两种方法能够有效改善HLA等位基因高分辨分型的准确性和重复一致率。

中国汉族人及维吾尔族人Rh血型基因结构多态性研究与分析

目的 研究中国汉族及维吾尔族家系的RHD基因结构。方法 采用聚合酶链反应 -序列特异性引物扩增 (PCR -SSP)方法 ,对汉族和维族Rh阴性家系的D基因结构多态性进行研究。结果 中国人RHD基因结构具有多态性 ,特别是带有C的个体 ;82例RHD血清学阴性个体中 ,完整携带十个外显子的有 14个样本 ,部分携带的有 6个样本 ,8个样本为完全缺失。结论 中国汉族人群与高加索人种有着显著的不同 。

类孟买型ABO基因的检测

为研究类孟买型ABO基因的分子基础 ,在吸收放散试验、唾液血型物质凝集抑制等血清学试验基础上 ,用PCR SSP法对 5例类孟买型样本进行ABO血型的基因定型 ,并进行ABO基因第 6、第 7外显子测序。结果表明 ,本研究的 5例类孟买血型样本 ,经PCR SSP法基因定型 ,其ABO基因型分别为A10 2B1、A10 2B1、A10 2O1、A10 2B1、B1O1;经直接测序实验 ,该 5例样本的ABO基因测序结果与PCR SSP基因定型结果相一致 ,未检测出新的点突变。结论 :应用PCR SSP方法可对类孟买型个体进行常规ABO基因定型 ,具有简便、快速、可靠的特点。

徐州汉族人ABO血型及HAB分泌型基因分型研究

目的 研究徐州汉族人群ABO血型及HAB分泌型基因多态性分布特征并用于解决临床输血中血型血清学鉴定难题。方法 用快速盐析法提取外周血标本中的DNA ,用PCR SSP扩增ABO血型、HAB分泌型等位基因。结果 1 0 4名健康、无血源关系的徐州汉族人ABO血型基因频率分别为A1:0 .1 53 8,A2 :0 .0 962 ,B :0 .2 4 52 ,O1:0 .50 4 8,O2 :未检测到 ( χ2 =6.73 2 3 ,P >0 .2 5,符合Hardy Weinberg公式 ) ;HAB分泌型基因频率分别为分泌基因Se:0 .980 8,非分泌基因se:0 .0 1 92 ( χ2 =0 .0 4 2 1 ,P >0 .75,符合Hardy Weinberg公式 )。 1份用血清学方法不能确定ABO血型的标本 ,用基因分型定为BO1型。结论 PCR SSP是一种方便、可靠的血型基因定型技术 ,与血型血清学方法相比本文非分泌基因se的频率显著偏低 ,4例血清学定为非分泌型个体用该方法鉴定基因型为Se/Se,间接提示G4 4 7A和G757A突变不能完全覆盖我国汉族人群的非分泌基因se。

应用ABO和STR基因分型技术鉴定混合血样

目的 探讨应用分子生物学方法鉴别混合血液样本的价值。方法 应用 STR基因分型和 ABO基因分型方法检测 2份血样 (标本 1、标本 2 )的 1 5个 STR基因座和 ABO基因型。结果 标本 2为 A型血样 ,而标本 1为标本 2与另一 B型或 AB型血的混合样本。结论 STR和 ABO基因分型等分子生物学技术可为疑难样本的鉴定提供一种简便、快速。

天蚕片、天蚕胶囊中僵蛹成分鉴定

目的基于特异性引物扩增建立中成药中僵蛹成分的鉴定技术。方法根据家蚕、白僵菌和绿僵菌的全基因组序列差异设计了特异性引物PM、PB和PA,采用CTAB法、三氯甲烷抽提法从供试品中提取与纯化DNA,并进行聚合酶链式反应(PCR),扩增产物以2%琼脂糖凝胶电泳检测。结果家蚕、白僵菌及绿僵菌的DNA经扩增后分别在61、94、144 bp处产生条带,且引物间无交叉反应,体现出很强的专属性,家蚕、白僵菌和绿僵菌DNA的检出限分别为1、0.1、1 ng。在6批天蚕片和天蚕胶囊中,均检测出家蚕和白僵菌,未检测出绿僵菌。结论该方法准确快速,可用于鉴定天蚕片和天蚕胶囊中的僵蛹成分。

河南省丹参根结线虫病原种类鉴定

【目的】旨在明确河南省丹参根结线虫的发病种类,为丹参根结线虫病的快速诊断和科学防控提供依据。【方法】2019—2021年,从河南省许昌市、三门峡市、南阳市等丹参种植园区采集根结线虫侵染发病的丹参样品。采用形态学、rDNA-ITS序列分析和特异性引物扩增相结合的方法对罹病丹参的根结线虫进行种类鉴定。【结果】形态学结果表明丹参根结线虫与南方根结线虫(Meloidogyne incognita)的形态特征一致。rDNA-ITS序列比对结果表明,丹参根结线虫与GenBank中的南方根结线虫序列具有高度相似性,最高可达100%。基于rDNA-ITS序列构建的系统发育树结果表明,丹参根结线虫种群与其他南方根结线虫种群以100%的支持率聚集在同一支。特异性引物检测结果也表明河南丹参根结线虫为南方根结线虫。同时,依据柯赫氏法则对分离的病原线虫进行致病性测定,发现接种株全部发病,人工接种南方根结线虫的丹参根部发病症状与田间病样症状一致。【结论】通过形态鉴定、分子鉴定和柯赫氏法则验证,明确了引起河南省丹参根结线虫病的病原线虫为南方根结线虫,这是河南地区首次发现南方根结线虫侵染丹参,有关部门应采取相应措施防止该病害在丹参种植区域进一步扩散蔓延。

小儿肺咳颗粒中鳖甲DNA分子鉴定

目的 建立小儿肺咳颗粒中鳖甲DNA分子鉴定方法。方法 根据鳖和佛罗里达鳖线粒体全基因序列的差异设计特异性引物PP2和PA3,采用CTAB法、酚仿抽提法提取、纯化DNA,并进行特异性引物扩增和方法学考察,产物以2%琼脂糖凝胶电泳检测。结果 鳖及佛罗里达鳖的DNA经扩增后分别在183、95 bp处产生条带,且未观察到非特异性扩增条带,引物PP2及PA3对两者DNA的检测限分别为0.10、0.010 ng/μL。有4批小儿肺咳颗粒中检出鳖DNA,未检出佛罗里达鳖DNA;6批产品两者DNA均未能检出。结论 该方法方便、可靠地鉴定小儿肺咳颗粒中鳖甲,有助于控制含鳖甲成方制剂的质量。

临床致病性不动杆菌的分子生物学鉴定

目的对临床致病性不动杆菌进行种属鉴定,并比较3种方法(44℃生长试验、特异性引物PCR扩增和16SrRNA测序)对鲍曼不动杆菌鉴定的特异性、准确性及应用价值。方法收集临床致病不动杆菌56株,首先接种在胰蛋白胨大豆肉汤中44℃进行培养,观察是否可以生长;其次,提取56株不动杆菌基因组DNA,用两组不同的特异性引物进行PCR扩增鉴定;最后,用通用引物对56株不动杆菌的16SrRNA进行测序鉴定。结果 56株不动杆菌中有17株可在44℃生长。经特异性引物PCR扩增鉴定,发现8株鲍曼不动杆菌和3株13TU型不动杆菌均可在44℃中较早较快生长。金标准16SrRNA测序确定56株不动杆菌中含有9个种,其中鲍曼不动杆菌和13TU型不动杆菌的鉴定结果与特异性引物PCR扩增法相同。结论应用分子生物学方法鉴定鲍曼不动杆菌具有准确、高效且可重复性高的优点,尤其是特异性PCR扩增法,可作为较难诊断的鲍曼不动杆菌的首选鉴定方法。

HLA-C基因5'端-35kb T/C多态性对HIV感染进展影响的研究

目的探讨HLA-C基因5'端-35kb C/T多态性(Rs9264942)在四川汉族HIV感染中的影响。方法采用序列特异性引物扩增(PCR-SSP)方法对四川汉族259例HIV感染进展组,46例HIV感染长期不进展组,和270例四川汉族对照组人群HLA-C基因5'UTR区域-35kb C/T的多态性进行分型。结果 -35kb C/T多态性在HIV感染进展组,HIV感染不进展组及正常对照组人群中各等位基因分布符合Hardy-Weinberg平衡,在HIV感染进展组中:CC频率为15.1%、CT频率41.3%、TT频率43.6%;HIV感染不进展组中:CC频率为21.7%、CT频率39.1%、TT频率39.1%;在正常对照组中:CC频率为18.9%、CT频率43.0%、TT频率38.1%。经统计学检验,-35kb C/T多态性中各等位基因频率在3组人群中没有统计学差异。结论 HLA-C基因-35kb C/T多态性与四川汉族HIV感染者的感染进程没有相关性。

异基因骨髓移植致ABO血型鉴定困难一例分析

目的对1例异基因骨髓移植术后患者进行疑难血型鉴定,保障临床输血安全。方法采用微柱玻璃珠法和试管法进行血清学试验,并结合聚合酶链反应序列特异性引物扩增(PCR-SSP)方法进行ABO基因分型。结果采用微柱玻璃珠法和试管法显示正反定型不一致,试管法增强试验后为O型,伴随血清抗体减弱,PCR-SSR基因检测表型为O型。结论根据患者血清学试验和基因检测结果,结合异基因骨髓移植史,判定血型为O型。

对HLA-B座位中低分辨中模棱两可基因分型的调查分析

人类白细胞抗原（HLA）是目前所知的最具有多态性的遗传系统之一,它位于人类第6号染色体短臂上,总长度3600 kb,约占人类基因组总长度的1/3000。整个HLA复合体共有数十个基因座,可分为HLA-Ⅰ类、HLA-Ⅱ类、HLA-Ⅲ类基因。HLA-B基因座属于HLA-Ⅰ类基因,它是HLA编码系统中最复杂,多态性最多的区域,由于其高变区各个等位基因差异仅在几个碱基,且只有极少等位基因某个高变区具有独立的碱基序列,因而交叉反应众多,故B位点往往出现定型困难［1］。尽管现有特异性寡核苷酸探针技术已经达到了中等分辨水平,但对于HLA-B座位上有些模棱两可的基因型尚不能分辨识别。作者所在实验室采用特异性寡核苷酸探针（PCR-SSO）技术对13485例HLA-B座位进行中低分辨调查分析,并对筛选出的模棱两可等位基因通过采用聚合酶链反应-序列特异性引物扩增（PCR-SSP）技术进行进一步确认。

2例Di(a+b-)血型的血清学及PCR-SSP检测分析

以往在血型血清学疑难配血中往往通过血型定型（AB0正反定型、RhDCE定型等），抗体筛查（筛选细胞、谱细胞等），抗体Coombs及吸收放散实验等步骤一般即可完成相应的配血过程。但在血清学检测条件不充分时如稀有血型抗体缺乏、谱细胞的谱型不全时等，对于稀有表型及存有高频抗原抗体的血液的配型，常规的检测方法与路径有时就显不够。此时如配合以血型基因分型检测可能的血型表型基因并判断相应的抗体存在，应当是解决问题的一个路径。我室最近在Diego系统抗体缺乏、谱细胞谱不完全的情况下，结合基因分型的方法，解决了2份存有抗高频抗原Dib抗体的定型与输血问题。