特异性检测卵形鲳鲹源哈维氏弧菌的核酸适配体的筛选与鉴定

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是海水养殖动物常见的主要致病菌之一,严重危害着我国华南沿海地区水产养殖业的健康可持续发展。针对哈维氏弧菌的快速检测诊断技术和抑菌技术等方面进行系统研究,并开发具有市场发展潜力的快速检测试剂盒和抗菌功能产品,对控制哈维氏弧菌的危害极其重要。为此,本研究以哈维氏弧菌为靶标,利用指数富集的配基系统进化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)技术,筛选特异性识别哈维氏弧菌的核酸适配体,并对核酸适配体的性质进行系统性研究。结果显示,核酸适配体H10、H13能高特异性和高亲和性地识别哈维氏弧菌,并且无毒副作用。同时,靶标性质分析表明核酸适配体(H10,H13)的靶标可能是细胞膜蛋白或膜蛋白相关成分。本研究运用SELEX技术筛选获得的ssDNA核酸适配体H10和H13,具有高特异性和亲和性,可用于研发操作便捷、灵敏度高的哈维氏弧菌快速检测技术。

实时荧光定量PCR定量方法研究进展

实时荧光定量PCR以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点而成为了分子生物学研究中的重要工具,综述了实时荧光定量PCR技术及其定量方法的研究进展,并展望了其应用前景。

三种方法检测乙肝表面抗原的结果分析

目的探讨三种方法对乙肝表面抗原的定性和定量检测的结果并进行对比分析。方法采用临床上常用的胶体金方法、酶联免疫吸附实验法(ELISA法)、化学发光微粒子免疫分析法(CMIA法)对400例标本进行乙肝表面抗原检测,分别计算ELISA法、CMIA法、胶体金法检测结果的阳性率、灵敏度和特异度。结果 CMIA方法检测乙肝表面抗原的阳性率、灵敏度和特异度高于ELISA法和胶体金法。结论 CMIA法检测乙肝病毒标志物特异性强、灵敏度高,具有很高的临床应用价值。

EB病毒抗体检测在儿童不明原因发热(FUO)诊断中的应用价值

目的 探讨EBV三种抗体(VCA-IgM、VCA-IgG、EA-IgG)在儿童不明原因发热(FUO)诊断中的应用价值.方法 采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测128例不明原因发热(FUO)儿童血清样本的EBV抗体.结果 (1)病例年龄1月～14岁,中位年龄3岁,【4岁87例,4～8岁26例,】8岁15例;(2)128例发热患儿中传染性单核细胞增多症65倒(50.8%),呼吸道感染40例(31.3%),另外还有过敏性紫癜、急性再生障碍性贫血、急性肾小球肾炎、肝炎等;(3)VCA-IgM阳性60例,阳性率46.88%.结论 三种EBV抗体能动态反应EB病毒感染后的抗体水平,敏感性高、特异性强、检测方法简单,在儿童不明原因发热(FUO)病因诊断中非常有价值.

检测日本血吸虫抗体的胶体金-葡萄球菌A蛋白试剂盒研制

目的研制胶体金-葡萄球菌A蛋白试剂盒用于检测日本血吸虫抗体。方法通过不同筛目尼龙绢和低频超声等方法,制备、纯化日本血吸虫可溶性虫卵抗原,研制胶体金-葡萄球菌A蛋白试剂盒。用该试剂盒检测人血清中日本血吸虫特异性抗体,并用ELISA方法进行平行比较。结果胶体金-葡萄球菌A蛋白试剂盒检测慢性血吸虫病的敏感性为93%,检测急性血吸虫病的敏感性为100%,检测健康人血清的特异性为96%,检测肺吸虫病的交叉反应为40%,对其他寄生虫和乙肝未见有交叉反应。与ELISA检测结果比较,两种方法具有良好的一致性。结论胶体金-葡萄球菌A蛋白试剂盒具有快速、简便、不需要仪器、敏感性高和特异性强等优点,可广泛用于血吸虫病流行区现场查病。

多重PCR技术检测食品中鼠伤寒沙门氏菌3%种毒力基因

该研究建立多重酶链式反应法快速检测鼠伤寒沙门氏菌3种毒力基因的检测方法。以鼠伤寒沙门氏菌毒力基因mgtC、inva、mogA、sseL、araB设计合成特异性引物,提取鼠伤寒沙门氏菌的DNA为扩增模板,通过单重聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction,PCR)验证引物特异性,利用引物特异性、Tm值等综合因素通过多重聚合酶链式反应技术(multiple polymerase chain reaction,MPCR)检测方法实现沙门氏菌多种毒力基因的检测,并优化MPCR试验参数,提高检测灵敏性。结果表明,在多对特异性引物中进行MPCR反应,筛选出mgtC、mogA、araB 3种毒力基因进行MPCR反应的特异性强、无交叉污染,且该方法能检测的最低灵敏度为0.0165 ng/μL。成功建立快速检测食品中沙门氏菌3种毒力基因的方法,该方法检测特异性强、灵敏度高,检测限低。

基于核酸适配体Q5的石斑鱼虹彩病毒快速检测技术

石斑鱼虹彩病毒(Grouper iridovirus,SGIV)在不同鱼群之间迅速传播,其致死率极高,严重制约了我国海水石斑鱼(Epinephelus tauvina)养殖业健康可持续发展。为了及早发现和鉴定出病原,降低经济损失,促进渔业发展,开发方便快捷的石斑鱼虹彩病毒检测技术已迫在眉睫。本研究基于核酸适配体Q5,研发出一种核酸适配体Q5荧光分子探针(Aptamer Q5 based fluorescent molecular probe,Q5-AFMP),并且对Q5-AFMP检测感染石斑鱼虹彩病毒的特异性,以及Q5-AFMP在细胞水平和组织水平检测石斑鱼虹彩病毒感染的灵敏度进行分析。研究结果表明:Q5-AFMP能够在细胞水平和组织水平高特异性检测出石斑鱼虹彩病毒的感染,而且具有较高的灵敏度。因此Q5-AFMP能够用于石斑鱼虹彩病毒的快速检测和诊断。

基于Crisper的新型冠状病毒核酸检测方法在临床应用中的评价

目的建立一种快速、特异性强、灵敏度高的新型冠状病毒核酸检测方法并评价其在临床工作中的应用。方法对2020年2月至5月经过RT-PCR及CT方法临床确诊的新冠患者标本,采用Crisper方法对50例正常标本及12例确诊标本进行检测,用本方法使12例确诊标本全部进行识别并检出,而用RT-PCR方法仅能检出10例,存在2例漏检的问题。结果Crisper方法特异性为100%;灵敏度为91.3%;精密度为高值批内精密度CV为0.66%,低值批内精密度CV为1.50%,均小于5%,符合试剂批内精密度要求;线性范围的相关系数r=0.9980,符合|r|≥0.980要求;可报告阳性为Ct值<37;验证方法符合要求。结论具有成本低、可多次重复检测、方法简单、检测速度快、灵敏,最低检测极限达到10-2拷贝/μL、特异,可在短时间内通过荧光信号的变化检测到是否含有目标核酸。

多重PCR技术在快速检测食源性致病菌中的研究进展

食品性致病菌是影响食品安全的重要因素之一,传统微生物检验方法检验周期较长、培养鉴定繁琐复杂,已越来越难以满足现代社会食品安全快速检测的需要,因而更加快速简便高效的检测方法成为科研热点。近年来,随着现代分子生物技术的发展,PCR技术由于具有特异性强、灵敏度高、操作简便、成本低等优点,越来越多的被应用于食源性致病菌的检测。

微柱凝胶卡交叉配血试验常见问题及处理

微柱凝胶卡交叉配血试验的原理:在微柱凝胶介质中,红细胞抗原与相应抗体结合,利用凝胶的空间位阻,经低速离心,凝集的红细胞悬浮在凝胶上层,而未和抗体结合的红细胞则沉于凝胶底部(管底尖部)。 微柱凝胶卡交叉配血试验的优点:微柱凝胶实验(又名微柱凝胶血型卡法)有结果清楚明确、结果稳定可保存、灵敏度高、特异性强、可标准化操作、自动化程度高、可检出IgG抗体、标本用量少、降低错误发生率的优点。

酶法测定糖化血清蛋白方法学探讨

目的对酮化氨基酸氧化酶法全自动测定糖化血清蛋白(GSP)的方法进行评价。方法用日立7060全自动生化分析仪检测GSP,观察试剂稳定性、不精密度、线性范围、抗干扰性、准确性、样品贮存温度和贮存时间,建立参考值范围。结果该法180秒达反应终点,线性达1266umol/L(Y=0.9866X+0.134,r=0.9997);批内CVl.54%,批间CV3.20%;平均回收率101.7%;TG<9.8mmol/L,BIL<675umol/L,Hb<200g/L,UA<3500umol/L,Glu<100mmol/L时对测定结果无显著干扰。120例健康人血清GSP参考值范围(x±2s):110umol/L-220umol/L。结论本法线性宽、特异性强、精密度高,干扰因素少,是测定GSP的较好方法。

检测犬恶丝虫病免疫层析试纸条的研制

以胶体金标SPA和犬恶丝虫抗原蛋白制备免疫层析试纸条,对300份犬血清进行检测,阳性检出率高达5.0%,同时用虫检法检测犬恶丝虫感染率,阳性检出率为4.0%。结果提示免疫层析试纸条具有操作简便、灵敏度高、特异性强的优点,可用于犬恶丝虫病的快速检测。

RT-PCR技术诊断猪繁殖与呼吸综合征

参照GenBank已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型代表株VR-2332的ORF6(M蛋白)基因序列,设计1对引物,扩增大约420 bp的基因片段,建立检测PRRSV的RT-PCR方法,同时应用该方法对PRRSV美洲毒株、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)及空白对照进行检测。结果显示,除PRRSV外,CSFV、PRV、PCV及空白对照的检测结果均为阴性。将250μL细胞培养的PRRSV提取RNA后,依次稀释成10-1～10-8,均能扩增出明显的目的条带;且多次重复均能得到一致的结果。表明本研究建立的RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高、重现性好的优点。用此方法对信阳市10县区疑似PRRS病例进行临床检测,检测病料478份,检出阳性病料265份,阳性率为55.4%。

肉品中莱克多巴胺残留的酶联免疫快速检测方法的建立

用自主制备的莱克多巴胺特异性抗体建立了猪肉样品中莱克多巴胺药物残留的间接竞争酶联免疫检测方法,对该检测体系的灵敏度、准确度、精密度、特异性等性能进行了测定,并将该检测系统与高效液相色谱法(HPLC)进行了对比分析。结果显示:莱克多巴胺药物残留的酶联免疫检测体系的检测范围为1～100 ng,灵敏度为0.12 ng/mL,检测限为1 ng/mL,回收率为80%～100%,与同类药物如盐酸克仑特罗、硫酸特布他林及硫酸克仑特罗的交叉反应率均小于0.01%;采用HPLC方法进行莱克多巴胺药物残留的检测时,其检测范围为10～200μg/mL,检测限为1μg/mL,回收率为83%～100%。该方法与高效液相色谱法相比灵敏度较高,特异性强,检测结果准确度相近,但是在检测结果稳定性方面逊于HPLC方法。