泛素特异性肽酶22诱导胰腺癌细胞对吉西他滨耐药的观察

目的:探讨泛素特异性肽酶22(ubiquitin specific peptidase 22,USP22)在胰腺癌吉西他滨耐药中的作用。方法:采用Western blot检测吉西他滨诱导不同胰腺癌细胞株对USP22表达情况的影响。利用胰腺癌SW1990亲本细胞株,构建吉西他滨耐药细胞株SW1990/Gem及USP22siRNA稳定表达细胞株(表示为SW1990-sh USP22、SW1990/Gem-sh USP22);采用CCK-8实验检测抑制USP22表达对胰腺癌细胞吉西他滨敏感性的影响。结果:1μmol/L或10μmol/吉西他滨诱导人胰腺癌PANC-1和SW1990细胞后,USP22表达均增高(P<0.05或P<0.01)。耐药细胞株SW1990/Gem中USP22蛋白表达显著高于SW1990亲本细胞株(P<0.01)。USP22 siRNA稳定表达细胞株SW1990-sh USP22,SW1990/Gem-sh USP22中USP22蛋白表达水平与相应对照组SW1990-NC,SW1990/Gem-NC相比,分别显著下调约65%(P<0.01)和60%(P<0.01)。SW1990-NC组和SW1990-sh USP22组对吉西他滨的IC50分别为(1 850.96±87.37)nmol/L和(534.83±49.68)nmol/L,差异具有统计学意义(P<0.01)。SW1990/Gem-sh USP22组对吉西他滨的IC50为(2 157.08±120.32)nmol/L,与SW1990/Gem-NC组(29 850.96±345.78)nmol/L相比,差异具有统计学意义(P<0.01);与SW1990-NC组(1 387.58±96.56)nmol/L相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:吉西他滨可诱导胰腺癌细胞USP22表达增高。抑制USP22表达可增加胰腺癌细胞对吉西他滨的药物敏感性,并可有效逆转胰腺癌细胞对吉西他滨的耐药。本研究揭示胰腺癌细胞对吉西他滨耐药的新机制,为改善胰腺癌个体化化疗方案提供新思路。

泛素特异性肽酶22、滋养层细胞表面抗原-2表达与鼻咽癌临床病理特征的关系及对预后的影响

目的探讨泛素特异性肽酶22(USP22)、滋养层细胞表面抗原-2(Trop2)表达与鼻咽癌(NPC)病人临床病理特征的关系及对预后的影响。方法选取2014年1月至2016年6月安阳市眼科医院NPC病人及其组织标本92例作为观察组,另选取同期慢性鼻咽炎病人及其组织标本95例作为对照组,检测对比两组USP22、Trop2蛋白表达水平及USP22、Trop2诊断价值。比较不同临床病理特征病人USP22、Trop2蛋白表达水平及其与NPC临床病理特征关联性。并对比不同USP22、Trop2表达水平病人3年无进展生存期及总生存期。结果观察组USP22(59.78%比12.63%)、Trop2(66.30%比15.79%)蛋白阳性表达率高于对照组(P<0.05);logistic回归显示:TNM分期、淋巴结转移、分化程度等3个因素均为USP22、Trop2蛋白表达的影响因素或关联因素(P<0.05);USP22、Trop2联合诊断准确性、敏感性高于二者单一诊断;TNM分期Ⅲ~Ⅳ期、低分化、淋巴结转移的NPC病人组织标本中USP22、Trop2蛋白阳性表达率高于TNM分期Ⅰ~Ⅱ期、中高分化、无淋巴结转移者(P<0.05);USP22、Trop2蛋白水平与TNM分期、淋巴结转移呈正相关,与分化程度呈负相关(P<0.05);USP22、Trop2蛋白阳性表达病人3年总生存率、无进展生存率低于阴性表达病人(P<0.05);USP22蛋白、Trop2蛋白高危组、低危组生存率对比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论Trop2、USP22蛋白表达水平在NPC病人中呈异常高表达状态,与TNM分期、分化程度、淋巴结转移存在一定关联性,加强Trop2、USP22蛋白表达水平联合检测,对早期识别NPC、评估预后具有重要指导意义。

泛素特异性肽酶22在结直肠癌多药耐药中的作用及与多药耐药基因P-糖蛋白的相关性

目的探讨泛素特异性肽酶22(USP22)在结直肠癌多药耐药中的作用以及与多药耐药基因P-糖蛋白(P-gp)和多药耐药相关蛋白1(MRP1)的相关性。方法筛选USP22低表达的结直肠癌细胞系RKO、SW480,转染USP22过表达质粒使USP22表达上调。用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测USP22对结直肠癌细胞奥沙利铂耐药的影响。用相同的奥沙利铂浓度处理细胞,Western印迹检测细胞中凋亡相关蛋白cleaved-caspase3、Bcl-2和耐药蛋白MRP1、P-gp的表达。细胞外排实验检测上调USP22对钙黄绿素AM(Calcein-AM)和罗丹明123(rhodamine123)的影响。免疫组化方法检测奥沙利铂化疗敏感组与耐药组中USP22、MRP1及P-gp的表达以及分析USP22与MRP1及P-gp的相关性。结果CCK-8实验结果表明,SW480-USP22(SW480细胞过表达USP22)对奥沙利铂处理24 h和48 h的IC50为(4.62±0.05)μmol/L和(2.32±0.04)μmol/L,与对照细胞相比分别高2.7倍和3.0倍。用1.25μmol/L的奥沙利铂处理细胞48 h,USP22过表达可抑制SW480细胞凋亡;细胞外排实验中SW480-USP22组Calcein-AM和rhodamine123的荧光强度与对照细胞相比明显升高,差异有统计学意义(均P<0.01);SW480-USP22细胞中MRP1和P-gp的蛋白表达水平与对照细胞相比显著增加,差异有统计学意义(均P<0.01)。免疫组化结果表明,奥沙利铂化疗敏感组USP22、MRP1、P-gp的阳性表达率和化疗耐药组相比显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),USP22与MRP1、P-gp在结直肠癌组织中的表达均呈正相关(r1=0.377,r2=0.423,P<0.05)。结论USP22上调与结直肠癌细胞对奥沙利铂的获得性耐药有关,USP22可能通过调控P-gp、MRP1的表达参与结直肠癌铂类化疗耐药的过程。

沉默泛素特异性肽酶22对人胃癌细胞增殖的影响及其机制

目的探讨泛素特异性肽酶22（USP22）对人胃癌细胞增殖的影响及其作用机制。方法设计、合成针对USP22特异性小干扰RNA（siRNA）片段，通过实时定量反转录聚合酶链反应（RT-qPCR）、Western blot筛选抑制效率最高的siRNA片段以备后续实验；抑制USP22后，噻唑蓝（MTT）法检测胃癌细胞SGC-7901细胞增殖，流式细胞术检测细胞周期及凋亡变化；抑制USP22后，Western blot检测周期、凋亡相关蛋白的表达变化。结果成功设计、合成针对USP22 siRNA片段，其抑制效率高达80%；USP22抑制后，胃癌细胞SGC-7901增殖明显受到抑制，细胞停滞于G0/G1期[（52.87±1.41）%比（73.73±1.78）%，t＝15.491，P＝0.000]。同时凋亡率显著增加[（19.63±0.82）%比（4.54±0.46）%，t＝58.051，P＝0.000]；Western blot结果显示bcl-2相关X蛋白（bax）表达水平显著上升（t＝9.580，P＝0.001）、B细胞淋巴瘤/白血病-2（bcl-2）及pro-半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3（Caspase-3）的表达量显著降低（t＝6.674、7.269；P＝0.000、0.000）；磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）及下游磷酸化糖原合成酶激酶3β（p-GSK3β）表达水平显著降低（t＝13.512、6.846；P＝0.003）。结论抑制USP22后，可能通过影响Akt活化，抑制胃癌细胞增殖及诱导细胞凋亡。

食管鳞状细胞癌组织中USP22、C-myc和Caspase-3蛋白的表达

目的:探讨特异性泛素肽酶22(USP22)、C-myc和Caspase-3蛋白在食管鳞状细胞癌组织中的表达及临床意义。方法:采用免疫组化SP法检测45例食管鳞状细胞癌组织、癌旁不典型增生组织及正常食管组织中USP22、C-myc和Caspase-3蛋白的表达,分析三者与食管鳞状细胞癌临床病理学特征的关系。结果:食管鳞状细胞癌、癌旁不典型增生和正常食管组织中USP22、C-myc、Caspase-3蛋白的阳性表达率比较差异具有统计学意义(χ2=39.614、41.838和33.889,P<0.001)。食管鳞状细胞癌组织中USP22、C-myc蛋白的表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、分化程度及临床分期有关(P<0.05),Caspase-3蛋白的表达与肿瘤分化程度有关(P<0.05);USP22蛋白与C-myc蛋白表达呈正关联(rP=0.559,P<0.001),两者与Caspase-3蛋白表达呈负关联(rP=-0.468和-0.477,P<0.001)。结论:USP22、C-myc高表达和Caspase-3低表达可能与食管癌发生发展相关。

泛素特异性肽酶22经Wnt/β-catenin通路调控结直肠癌化疗耐药的机制研究

目的探讨泛素特异性肽酶22(USP22)作用于Wnt/β-catenin信号通路参与结直肠癌的发生和化疗耐药的分子机制。方法采用氟尿嘧啶(5-Fu)处理结直肠癌细胞株HT-29,建立耐药细胞株HT-29/5-Fu;构建USP22 siRNA稳定表达细胞株(表示为HT-29-sh USP22、HT-29/5-Fu-sh USP22)。CCK-8法检测HT-29/5-Fu细胞对5-Fu的敏感性、抑制USP22表达后结直肠癌细胞对5-Fu敏感性的影响;采用Western blotting检测不同质量浓度5-Fu诱导下HT-29细胞中USP22蛋白表达,HT-29和HT-29/5-Fu细胞中USP22和β-catenin蛋白表达,以及抑制USP22表达对结直肠癌细胞USP22、β-catenin表达的影响。结果 (1)HT-29与HT-29/5-Fu细胞对5-Fu的IC_(50)值分别为(1.58±0.23)mg/L和(14.58±0.94)mg/L,其中HT-29/5-Fu细胞对5-Fu的敏感性显著下降(n=6,t=8.476,P<0.01)。(2)在0.5、5.0 mg/L的5-Fu诱导后,HT-29细胞内USP22蛋白表达水平(USP22/β-actin)显著升高(0.5 mg/L vs 0 mg/L:t=7.618,P<0.05;5.0 mg/L vs 0 mg/L:t=6.992,P<0.05)。HT-29/5-Fu组中USP22蛋白表达水平为0.92±0.11,显著高于HT-29组的0.18±0.06(t=7.618,P<0.05)。(3)HT-29-sh USP22组对5-Fu的IC_(50)为(0.25±0.23)mg/L,显著低于HT-29组(t=6.662,P<0.01)。HT-29/5-Fu-sh USP22组对5-Fu的IC_(50)为(1.36±0.14)mg/L,显著低于HT-29/5-Fu组(t=7.002,P<0.01),但与HT-29组相比,差异无统计学意义(t=1.586,P>0.05),抑制USP22表达可增强结直肠癌细胞HT-29对5-Fu的敏感性。(4)HT-29-sh USP22组的USP22蛋白表达水平为0.07±0.01,与HT-29组相比下调(t=7.105,P<0.01)。HT-29/5-Fu-sh USP22组的USP22蛋白表达水平为0.33±0.02,与HT-29/5-Fu组相比,USP22蛋白表达水平下调(t=6.153,P<0.01)。HT-29-sh USP22、HT-29/5-Fu-sh USP22中β-catenin蛋白表达水平与相应对照组HT-29、HT-29/5-Fu相比显著下调(HT-29-sh USP22 vs HT-29:t=8.823,P<0.01;HT-29/5-Fu-sh USP22vs HT-29/5-Fu:t=7.656,P<0.01)。结论 5-Fu可诱导结直肠癌细胞USP22表达增高。抑制USP22表达可增加结直肠癌细胞对5-Fu的药物敏感性,其机制可能是抑制Wnt/β-catenin信号通路,从而有效逆转结直肠癌细胞对5-Fu的耐药。

泛素特异性肽酶22调控乙型肝炎病毒X蛋白水平及功能

目的探究泛素特异性肽酶22(ubiquitin specific peptidase 22,USP22)与乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)相互作用对HBx蛋白水平及其生物学功能的影响。方法通过GST pull-down、免疫共沉淀以及激光共聚焦试验检测HBx与USP22的相互作用。瞬时转染USP22真核表达质粒或干扰USP22表达的siRNA,Western blot检测肝细胞中HBx蛋白表达水平的变化。以环己酰亚胺(cycloheximide,CHX)、蛋白酶体抑制剂MG132(carbobenzoxy-Leu-Leu-leucinal,MG132)分别处理转染后的细胞,检测HBx蛋白的降解速率。进一步通过细胞内泛素化试验检测USP22对HBx泛素化的影响,明确USP22影响HBx蛋白稳定性的具体机制。最后,以双荧光素酶报告试验和平板克隆试验检测USP22对HBx生物学功能的影响。结果USP22与HBx存在相互作用。USP22显著增加HBx蛋白稳定性,并通过去除HBx的泛素化抑制HBx通过蛋白酶体降解,进而增强HBx的生物学功能。结论USP22抑制HBx通过泛素依赖-蛋白酶体途径降解,增强HBx蛋白稳定性并促进HBx功能。

siRNA沉默USP22基因对胃癌细胞增殖的抑制作用

目的:探讨小干扰RNA(siRNA)沉默泛素特异性肽酶22(ubiquitin specific peptidase22,USP22)对胃癌细胞增殖的影响.方法:针对USP22基因设计3条siRNA及阴性siRNA,用脂质体Lipofectamine 2000转染胃癌AGS细胞,通过实时定量PCR和Western blot检测转染后AGS细胞USP22基因中mRNA和蛋白表达水平的变化情况,流式细胞术检测细胞周期分布变化情况,CCK8法检测细胞增殖率及抑制率.结果:转染48h后,3条siRNA均能显著抑制USP22 mRNA和蛋白的表达.其中,以转染USP22 siRNA3后效果最明显,mRNA和蛋白表达分别下降80.47%±2.99%和79.40%±3.58%.细胞增殖明显受到抑制,USP22 siR-NA3组细胞增殖抑制率为27.33%±3.49%.细胞周期中G0/G1期细胞增多,S期细胞减少.结论:采用RNA干扰技术能够有效地沉默USP22基因的表达,并显著抑制胃癌细胞的增殖.

siRNA沉默USP22基因对胶质瘤细胞增殖的抑制作用

目的探讨小干扰RNA(si RNA)沉默泛素特异性肽酶22(ubiquitin specific protease 22,USP22)对胶质瘤细胞增殖的影响和作用机制。方法合成USP22 si RNA及阴性对照si RNA(control si RNA),用脂质体Lipofectamine 2000转染至人胶质瘤U87和U251细胞,分别设为实验组和阴性对照组。通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测两组胶质瘤细胞USP22 mRNA和蛋白表达水平的变化。采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)检测USP22 si RNA对两组胶质瘤细胞的增殖抑制率。流式细胞术定量检测USP22 si RNA对胶质瘤细胞凋亡及细胞周期分布的影响。Western blot检测胶质瘤细胞凋亡蛋白和周期调控蛋白的表达。结果与阴性对照组比较,实验组胶质瘤细胞中USP22 mRNA和蛋白表达显著下降(P<0.05),细胞增殖明显受到抑制(P<0.05),凋亡率明显上升(P<0.05),细胞周期中G2/M期的细胞比例明显增高(P<0.05)。Western blot结果显示:细胞凋亡蛋白Procaspase-3、Procaspase-8、Procaspase-9表达明显下降(P<0.05);细胞周期蛋白CDK1、CDK2、Cyclin B1表达水平明显下降(P<0.05),Cyclin D1表达水平无明显变化(P>0.05)。结论 USP22基因在胶质瘤细胞的增殖中发挥重要作用,其机制可能为调节细胞凋亡和细胞周期。

USP22在神经母细胞瘤中的表达及意义的初步研究

目的观察肿瘤干细胞标记物泛素特异性肽酶22（USP22）蛋白在神经母细胞瘤中的表达，探讨其在神经母细胞瘤发生发展过程中的作用。方法用免疫组化法检测USP22蛋白在68例神经母细胞瘤组织和瘤旁组织细胞中的表达，结合临床资料分析其与临床病理学特征的关系。结果免疫组织化学染色结果显示USP22主要在肿瘤细胞核中呈阳性表达，而瘤旁组织中呈阴性表达。进一步统计分析，USP22在Ⅲ-Ⅳ期肿瘤中的表达水平高于Ⅰ～Ⅱ肿瘤（P〈0．05）；USP22在有淋巴结转移组的表达水平明显高于无淋巴结转移组（P〈0．05）；而USP22在神经母细胞瘤中的表达水平与性别、年龄、大小、肿瘤部位、病理分型等参数无相关性（P〉0．05）。结论USP22在神经母细胞瘤细胞中有表达，其表达水平与肿瘤的临床分期及是否淋巴结转移有相关性，与性别、年龄等参数无明显相关性。

宫颈病变组织中USP22、HIF-1α表达变化

目的观察宫颈病变组织中泛素特异性肽酶22(USP22)、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)表达变化。方法选择15例正常宫颈(对照组)、25例CIN(CIN组)、45例宫颈癌(宫颈癌组)患者的宫颈组织,分别用免疫组化法、RT-PCR法检测各组宫颈标本中的USP22、HIF-1α蛋白及mRNA。结果对照组、CIN组、宫颈癌组USP22蛋白阳性表达率分别为0、32.0%、57.8%,HIF-1α蛋白阳性表达率分别为20.0%、56.0%、82.2%。各组USP22、HIF-1α蛋白阳性表达率比较,P均<0.05。对照组、CIN组、宫颈癌组USP22 mRNA相对表达量分别为1.047±0.339、2.214±0.866、5.822±5.489,HIF-1αmRNA相对表达量分别为1.048±0.315、2.305±1.083、4.313±3.122,各组USP22、HIF-1αmRNA相对表达量比较,P均<0.05。结论宫颈组织USP22、HIF-1α表达随宫颈病变恶性程度提高而升高,二者共同参与宫颈恶性病变的发生发展过程。

抑制USP22表达对胶质瘤细胞顺铂耐药的影响

目的:探讨泛素特异性肽酶22 (ubiquitin specific peptidase 22,USP22)对胶质瘤细胞顺铂耐药的作用。方法:采用顺铂剂量梯度爬升筛选方法诱导顺铂耐药胶质瘤细胞株U251/CP2,转染USP22小干扰RNA沉默胶质瘤顺铂耐药细胞株U251/CP2中USP22的表达,RT-PCR检测细胞USP22 mRNA的表达水平,流式细胞术检测转染USP22-shRNA对细胞凋亡的影响,CCK-8法检测细胞的活力及耐药指数,Western blotting检测USP22的蛋白水平。结果:成功构建了顺铂耐药胶质瘤细胞株U251/CP2、USP22基因沉默细胞株U251-shUPS22和U251/CP2-shUSP22。抑制USP22的表达可以明显提高U251/CP2-sh USP22细胞的凋亡率(P <0. 05),顺铂上调USP22蛋白在U251和U251/CP2细胞中的表达(P <0. 01)。U251-shUPS22、U251/CP2和U251/CP2-shUSP22各组细胞的顺铂半数抑制浓度分别为(0. 56±0. 07)μg/mL、(73. 73±2. 74)μg/mL和(51. 25±1. 09)μg/mL,与对照U251组(1. 23±0. 13)μg/mL比较差异均有统计学意义(P <0. 01)。结论:抑制USP22表达可增强胶质瘤细胞对顺铂的敏感性,且可在一定程度上逆转耐药细胞株的顺铂耐药,提示USP22是胶质瘤顺铂耐药的潜在分子机制之一。

抑制USP22基因对人结直肠癌细胞增殖的影响

目的 利用RNA干扰技术探讨泛素特异性肽酶22(USP22)对人结直肠癌细胞增殖的影响。方法免疫荧光检测结直肠癌组织中USP22的表达;Western blotting检测体外培养的HCT-116、SW480、HC-29结直肠癌细胞株中USP22的表达,筛选出表达量最高的细胞作为研究细胞。设计、合成针对USP22特异性siRNA,同时设置阴性对照siRNA,利用脂质体转染结直肠癌细胞后,Western blotting检测siRNA抑制效率;通过MTT法检测细胞的增殖能力;流式细胞术检测细胞的周期及凋亡;Western blotting检测周期相关蛋白CyclinB1、p21、p53、CDK2的表达。结果 结直肠癌组织中USP22表达量与癌旁组织比较,差异有统计学意义(P<0.05),结直肠癌组织中USP22表达量升高。SW480细胞中USP22的表达量最高,因此作为靶细胞进行后续研究。与对照组比较,USP22 siRNA能够降低USP22的表达(P<0.05)。USP22抑制后,与对照组比较,能够抑制SW480细胞的增殖,促使SW480细胞停滞于G0/G1期,抑制细胞周期进程,增加细胞凋亡率(P<0.05),进而抑制细胞增殖(P<0.05);同时,与对照组比较,CyclinB1、CDK2的表达量降低(P<0.05),p53和p21的表达量升高(P<0.05)。结论 USP22抑制后,能够抑制结直肠癌细胞的增殖,其机制可能与抑制细胞周期进程、促进细胞凋亡有关。