抗原特异性细胞毒T细胞检测及其临床意义

抗原特异性细胞毒 T细胞 (CTL)在控制病毒感染和某些肿瘤中具有重要作用。用 MH C- 类分子的 α链和β2 -微球蛋白、抗原肽和有荧光染料标记的联接蛋白组成的四聚体试剂 ,可以检测相应的抗原特异性 CTL。这项技术将对病毒性疾病和肿瘤的发病机制、患者体内细胞免疫功能的了解具有重要的意义 ,也为这些疾病的细胞免疫治疗提供新的方法。

乙型肝炎病毒特异性细胞毒T细胞实验研究技术进展

由于乙型肝炎病毒(HBV)感染中抗原特异性细胞毒T细胞(CTL)在病毒清除和肝细胞损害中的重要作用,使其成为研究热点之一。本文对HBV抗原特异性CTL的实验研究技术进展作一综述。涉及的实验方法包括51Cr释放实验,乳酸脱氢酶释放法,有限稀释法,MHC-I类分子-肽四聚体,酶免疫斑点技术和流式细胞技术等。上述方法分别用于对HBV抗原特异性CTL表达频率,细胞毒功能,以及CTL表达与分泌细胞因子功能的测定。

树突状细胞体外刺激对HBV特异性细胞毒T细胞影响的研究

目的探讨通过聚肌胞体外作用树突状细胞后改善慢性乙型肝炎患者树突状细胞功能,并在体外活化自身T细胞获得高频数HBV特异性细胞毒性T细胞(CTL)的方法。方法分离慢性乙型肝炎病人外周血单个核细胞,在粒巨噬细胞集落刺激因子(GM CSF)和白细胞介素4(IL4)的诱导下培养树突状细胞。培养的第7天加入聚肌胞刺激获得成熟树突状细胞,经HBVcore1827肽负载后与自身T淋巴细胞共培养,通过酶联斑点计数法(Elispot)及MHC肽四聚体法(Tetramer)比较病人T细胞未经自身树突状细胞刺激组、经HBVcore1827肽负载的自身树突状细胞刺激组、经聚肌胞促成熟的HBVcore1827肽负载的自身树突状细胞刺激组中HBV特异性的CTL的功能和频数。结果慢性乙型肝炎病人外周血单核细胞体外经GM CSF和IL4诱导可转化为树突状细胞,树突状细胞转化过程中聚肌胞的刺激可显著上调树突状细胞表面分子CD80、CD83的表达(P<0.01),促进树突状细胞的成熟。Elispot法检测分泌IFNγ的CTL的频数病人T细胞未经自身树突状细胞刺激组分泌频数为(9～28)/1×105T细胞,均值16;经HBVcore1827肽负载的自身树突状细胞刺激组频数为(30～67)/1×105T细胞,均值为46;经聚肌胞促成熟的HBVcore1827肽负载的自身树突状细胞刺激组频数为(59～130)/1×105T细胞,均值为98。三组数据?

免疫球蛋白重链框架区的抗原九肽诱导特异性细胞毒T细胞增殖

目的 探索免疫球蛋白重链可变区 (IgHV)是否存在T细胞识别的表位。 方法 PCR扩增 10 8例急性淋巴细胞白血病 (ALL)的 7个IgHV家族的重排基因 ,PCR产物直接测序并翻译成氨基酸。利用互联网生物信息资源分析B ALLIgHV基因的重排类型和基因变异 ,利用SYFPEITHI和BIMAS软件预测IgHV基因编码蛋白质的T细胞表位。合成代表性九肽IgHV1家族的QLVQSGAEV ,进行T2结合分析、合成九肽诱导的T细胞扩增、扩增细胞的HLA A 0 2 0 1/QLVQSGAEV四聚体检测等实验 ,确定合成九肽的免疫原性。结果 6 6 %的B ALL检测到IgHV基因重排克隆。在 4 0份测序得到的B ALLIgHV序列中 ,选出 2 6份进行HLA A 0 2 0 1分子结合九肽的预测 ,发现 7个IgHV家族共有 12条抗原九肽。除 1条位于第 3互补决定区 (CDR3)外 ,10条(83% )位于框架区 (FR) ,并与相应胚系VH 家族的代表序列相同 ;为同一IgHV家族的白血病细胞所共有。合成的IgHV1抗原九肽可将T2细胞表面HLA A 0 2 0 1分子的表达提高 1 6 3倍。HLA A 0 2 0 1正常供者的外周血淋巴细胞接受该九肽负荷的自身PBMC的 1轮刺激 ,CD8+ 四聚体 + 细胞达1 6 4 % ,继续接受该九肽负荷的T2细胞的 2轮刺激 ,CD8+ 四聚体+ 细胞增至 82 5 7%。

特异性细胞毒T淋巴细胞治疗HCMV感染的研究进展

人巨细胞病毒 (HCMV)的感染是普遍的 ,所致的危害也很严重。目前药物防治已被普遍选择 ,尽管它能限制 HCMV感染的发展 ,但其副作用使临床把希望寄托于免疫预防和治疗。 HCMV的感染后果主要决定于宿主的免疫状况 ,其中特异性 CTL起着关键作用。大量资料已证明 ,HCVM特异性 CTL可用于预防和治疗HCMV的激活与疾病。

人类免疫缺陷病毒感染中的特异性细胞毒T淋巴细胞反应(二)

(接上期) 2.4粘膜中的细胞免疫由于HIV主要是通过性接触传播,病毒通过粘膜入侵机体,对于暴露部位局部的免疫功能的研究也是目前的一个热点.现在认为粘膜处抗HIV免疫反应主要有以下特点[9]:(1)经典的粘膜免疫反应是由特异性IgA介导的,但在HIV感染中,对病毒env特异性的IgG在口腔、鼻粘膜及生殖道处占了优势.但是,由于这类特异抗体并无中和保护作用,其出现于疾病的进展无一定的联系.(2)与体内其它部位相似,细胞免疫是粘膜处抗HIV的主要免疫反应.CTL反应对控制病毒数量起决定作用.(3)由于HIV在粘膜处的传播主要是通过嗜巨噬细胞毒株来实现的,妇女在暴露后仅有一部分入血.可能是由于这个原因,生殖道粘膜中的CTL反应可识别的病毒表位谱较血中窄,具有更强的限制性.(4)在人类唾液腺中存在一种称为唾液白细胞蛋白酶的抑制因子.该因子在体外可以有效地控制HIV,同时,在唾液中HIV通常呈阴性,这说明该物质可以有效地抑制HIV通过口腔粘膜传播,其机制可能是妨碍病毒与靶细胞的接触.

人类免疫缺陷病毒感染中的特异性细胞毒T淋巴细胞反应(一)

特异性细胞毒T淋巴细胞(Cytoxic T Lymphocyte,CTL)是一类可以杀伤表达特异性抗原靶细胞的T细胞亚群.CTL是抗细胞内感染(病毒、单核细胞增多性李斯特菌等)、急性同种异型移植物排斥反应和杀伤肿瘤的重要效应细胞[1].

负载乳腺癌细胞冻融抗原的DC对CTL体外特异性杀伤活性的影响

目的:研究乳腺癌患者腋下淋巴结单个核细胞来源的DC,经自体肿瘤细胞冻融抗原刺激后,对CTL体外特异性杀伤活性的影响。方法:以细胞因子分别诱导、培养乳腺癌腋下淋巴结单个核细胞中的DC及TDLNC,用自体癌细胞冻融抗原刺激DC,并和TDLNC共培养,诱导成为肿瘤抗原特异性CTL;检测特异性CTL对自体乳腺癌细胞及MCF-7细胞的体外杀伤活性。结果:DC-Ag-TDLNC、DC-TDLNC和TDLNC对自体乳腺癌细胞的杀伤率分别为67.64%、31.25%和26.36%,P<0.001;三种TDLNC细胞对MCF-7细胞的杀伤率无明显差异(P>0.05)。结论:乳腺癌患者腋下引流淋巴结中的单个核细胞在细胞因子的诱导、活化及自体肿瘤抗原刺激下,可分化为成熟DC,DC可促进TDLNC增殖、分化为特异性CTL,后者对自体肿瘤细胞有较高的杀伤活性。

乙肝病毒核心抗原特异性CD8^+细胞毒T淋巴细胞及相关细胞因子与HBV-DNA、ALT的相关性研究

目的探讨乙型肝炎(乙肝)病毒核心抗原特异性CD8^+细胞毒T淋巴细胞及相关细胞因子与乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)、谷丙转氨酶(ALT)的相关性。方法选择47例急性乙肝患者作为急性乙肝组,同期39例慢性乙肝活动期患者作为慢性乙肝组,同期28例健康体检者作为对照组,比较三组核心抗原特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞及相关因子(Core18-27、Env335-343、Pol575-583)、HBV-DNA、ALT、谷草转氨酶(AST)、谷氨酰基转移酶(GGT)、总胆红素(TBIL)水平,分析乙肝病毒核心抗原特异性CD8+细胞毒T淋巴细胞及相关因子与HBV-DNA、ALT的相关性。结果急性乙肝组Core18-27、Env335-343、Pol 575-583水平分别为(1.24±0.51)%、(0.09±0.01)%、(0.09±0.02)%,高于对照组的(0.09±0.02)%、(0.06±0.02)%、(0.07±0.02)%和慢性乙肝组的(0.05±0.01)%、(0.04±0.01)%、(0.03±0.01)%,且对照组均高于慢性乙肝组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。急性乙肝组HBVDNA、ALT、AST、GGT及TBIL水平分别为(21.59±4.32)×10^3 copies/ml、(85.35±5.49)U/L、(120.59±12.19)U/L、(125.98±13.42)U/L、(40.39±1.32)μmol/L,均高于慢性乙肝组的(13.21±3.29)×10^3 copies/ml、(62.14±5.05)U/L、(87.56±6.87)U/L、(102.12±10.06)U/L、(25.49±1.21)μmol/L和对照组的0、(32.21±3.25)U/L、(30.29±3.41)U/L、(33.49±3.09)U/L、(12.59±0.14)μmol/L,且慢性乙肝组高于对照组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。Core18-27、Env335-343和Pol 575-583与HBV-DNA、AST、ALT、GGT及TBIL水平均呈正相关(P<0.05)。结论乙肝病毒核心抗原特异性CD8+细胞毒T淋巴细胞及相关细胞因子与HBV-DNA、ALT存在相关性,加强其表达水平测定反映疾病严重程度,有助于指导临床治疗。

特异性细胞毒T淋巴细胞治疗慢性乙型肝炎

近年来HBV免疫病理学研究提示:HBV抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)在清除肝内HBV的免疫反应过程中起着关键性的作用。因此,增强特异性CTL的功能,可能有助于清除肝内HBV,从而起到治疗作用。1992笔者在中国医学科学院基础医学研究所单克隆抗体研究室朱力平教授的帮助和指导下,建立了体外制备HBV特异性CTL的方法,并自1992～1995进行了3期前瞻性、多中心临床试验,现报告如下:1 资料与方法1.1 病例选择标准

人细胞毒T淋巴细胞杀伤胃癌细胞及诱发凋亡的实验研究

目的 测定特异性细胞毒 T淋巴细胞 (CTL )对胃癌细胞的体外杀伤活性及观察形态学改变。方法 用分离胃腺癌患者的癌细胞经丝裂霉素 C处理后 ,作为抗原与抗CD3单克隆抗体、重组白细胞介素 - 2刺激患者自体外周血单个核细胞 ,体外诱导 CTL,用 MTT比色法测定 CTL 对自体癌细胞、人胃癌细胞株 (BGC- 82 3和 MGC- 80 3)的体外杀伤活性。将 CTL与 BGC- 82 3共同温育 ,通过透射和扫描电镜观察杀伤靶细胞的形态改变。结果 CTL对自体胃癌细胞有特异性杀伤作用 ,可使靶细胞凋亡或溶解坏死。结论 体外混合细胞培养诱导出的 CTL。

乙型肝炎病毒特异性T细胞治疗慢性乙型肝炎的临床研究

据62例慢性乙型肝炎分组治疗观察,治疗组HBV DNA阴转率33.3％,对照组为11.1％,HBeAg阴转率和抗-HBe阳转率分别为44.4％和33.3％,对照组分别为13.3％和10.0％。治疗结束后半年随访HBV DNA、HBeAg阴转率和抗-HBe阳转率分别为50.0％、55.6％和44.4％。故认为HBV特异性细胞毒T淋巴细胞治疗,对慢性乙型肝炎可获满意临床效果。

乳腺癌患者腋下淋巴结来源的DC诱导自体特异性CTL的实验研究

目的:研究乳腺癌患者腋下淋巴结单个核细胞来源的树突状细胞(DC)诱导抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)的能力。方法:以多种细胞因子联合诱导腋下淋巴结单个核细胞中的贴壁细胞为DC,非贴壁细胞与IL-2共培养后诱导成为肿瘤区域引流淋巴结细胞(TDLNC),用自体乳腺癌细胞冻融抗原刺激DC,并和TDLNC共培养,以诱导肿瘤抗原特异性CTL。结果:淋巴结细胞经体外培养后,贴壁细胞在DC诱导前,其特异性表面标志物CD1a、CD83、CD86的百分比(%)分别为11.0±2.4、26.6±5.2和33.0±6.1,经与rhGM-CSF、rhIL-4共同培养,并经自体肿瘤冻融抗原加TNF-α诱导后3种标志物的水平升高,其百分比(%)分别为50.2±5.7、60.5±16.5和56.2±16.4(P<0.01)。TDLNC中CD3+和CD8+细胞含量(%)分别为73.9±2.2和32.8±3.2;经DC和肿瘤抗原诱导后,DC-Ag-TDLNC中的CD3+和CD8+细胞含量升高,其百分比(%)分别为82.7±2.8和62.5±2.5(P<0.01)。结论:乳腺癌患者腋下引流淋巴结中的单个核细胞在rhGM-CSF和rhIL-4刺激活化和自体肿瘤抗原及TNF-α的诱导下,可以分化为典型的DC。成熟的DC具有较强的抗原提呈功能,可以促进TDLNC增殖、分化为抗原特异性CTL。

EBV-CTL治疗异基因造血干细胞移植后难治性EB病毒感染的分析

目的研究EB病毒特异性细胞毒T淋巴细胞(EBV-CTL)治疗异基因造血干细胞移植后难治性EBV感染的疗效。方法报道4例EBV-CTL治疗异基因造血干细胞移植后难治性EBV感染病例并结合文献分析。结果 3例取得了较好疗效,分别于治疗后1、2、3个月转阴,分别随访8、12、6个月未复发,仅有1例在EBV-DNA转阴后第6个月复发,再次EBV-CTL治疗后,迅速进展为移植后淋巴细胞增殖性疾病(PTLD),治疗无效死亡。结论 EBV-CTL是治疗难治性EBV感染的一种有效手段,但仍有部分病例治疗无效,值得进一步探讨和研究。

DC荷载α-GalCer联合肿瘤特异性CTL对小鼠Heps肝癌移植瘤生长的影响

目的:探讨树突状细胞(DC)荷载α-半乳糖神经酰胺(α-GalCer)联合肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)对小鼠Heps肝癌移植瘤生长的抑制作用。方法:诱导扩增小鼠骨髓来源的DC细胞和T淋巴细胞,培养成为具有肿瘤特异性的CTL,DC细胞体外荷载α-GalCer。建立Heps肝癌移植瘤模型,将36只模型鼠随机分为4组(n=9),分别尾静脉给予生理盐水(对照组)、CTL(CTL组)、DC荷载α-GalCer(DC荷载α-GalCer组)、DC细胞荷载α-GalCer+CTL(联合治疗组)输注。每隔两天测量移植瘤体积,观察体积变化。于治疗后第14d,处死小鼠,取眼球血及瘤体组织。流式细胞术(FCM)检测外周血CD4^+、CD8^+T细胞比例。免疫组织化学染色观察肿瘤组织中Bcl-2/Bax凋亡蛋白的表达。结果:与对照组相比,各治疗组均可抑制肿瘤的生长,差异具有统计学意义(P<0.01);联合治疗组较DC荷载α-GalCer组及CTL组肿瘤体积明显减小(P<0.05)。联合治疗组小鼠外周血CD4^+、CD8^+T细胞数量较另外三组显著升高(P<0.05);对照组、CTL组、DC荷载α-GalCer组小鼠外周血中CD4^+、CD8^+T细胞含量无明显差异(P>0.05)。与对照组相比,各治疗组移植瘤内Bax阳性细胞数量明显增加(P<0.05),Bcl-2阳性细胞数量明显减少(P<0.05);与CTL组和α-GalCer组相比,联合治疗组移植瘤内Bax阳性细胞明显增加(P<0.05),Bcl-2阳性细胞明显下降(P<0.05)。结论:DC荷载α-GalCer与肿瘤特异性CTL联合应用能够对小鼠Heps肝癌移植瘤具有协同杀伤作用。

HBV组织相容性复合物-抗原肽五聚体在特异性细胞毒T淋巴细胞检测中的应用

组织相容性复合物（MHC）-抗原肽五聚体（Pentamer）复合物是目前检测特异性细胞毒T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）最为敏感而特异的方法之一，正被广泛应用于多种病毒感染性疾病发病机制的研究以及作为临床感染转归的预测指标。但由于外周血淋巴细胞中特异性CTL的数量非常低，对于如何确定特异性CTL频数存在相当大的困难。

激发型CD40单克隆抗体联合特异性细胞毒T淋巴细胞对B细胞淋巴瘤的免疫治疗作用

目的 研究激发型CD40单克隆抗体5C11联合特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）对B细胞淋巴瘤的免疫治疗作用。方法 人B细胞淋巴瘤Daudi细胞株经5C11刺激24或48h，Annexin V／PI结合实验测定凋亡率，流式细胞术检测Fas表达率。外周血单个核细胞来源的树突状细胞（DC），经凋亡Daudi细胞负载、5C11诱导成熟后，与自体T细胞混合培养，激发特异性CTL，JAM法检测5C11、CTL或5C11联合CTL对Daudi细胞的杀伤效应。皮下注射Daudi细胞，建立人源化SCID小鼠B细胞淋巴瘤模型；接种肿瘤细胞1周、3周后，分别经腹腔注射5C11、CTL、5C11＋CTL进行治疗，通过肿瘤生长曲线、荷瘤小鼠生存期评价疗效。结果 5C11作用后，Daudi细胞表面Fas的表达率显著上调，但细胞凋亡率没有明显改变。特异性CTL能有效杀伤靶细胞，且与5C11联合应用后，Daudi细胞DNA片段形成率显著增高，8h为71．9％±4．0％，12h达82．6％±4．4％。经5C11、CTL、5C11联合CTL治疗后，荷瘤小鼠体内肿瘤生长速度均显著减缓，而且在低肿瘤负荷小鼠中，CTL、5C11联合CTL治疗分别取得了30．0％和70．0％的完全缓解率，与对照组相比，各治疗组小鼠生存期显著延长。结论 激发型CD40单抗5C11可显著上调细胞表面Fas的表达，增强Daudi细胞对诱导凋亡的敏感性，从而促进肿瘤特异性CTL的体外杀伤和体内治疗效应。

淋巴细胞与肝癌细胞混合培养诱导特异性细胞毒T淋巴细胞的形成

目的通过肝癌细胞和淋巴细胞混合培养 ,体外诱导产生高活性的肝癌特异性细胞T淋巴细胞 (H S CTL)。方法采用淋巴细胞和肝癌细胞混合培养技术 ,在IL 1,IL 2 ,IL 4和IL 6刺激下 ,诱导产生H S CTL ,应用间接免疫荧光法和51Cr释放法检测其对靶细胞的杀伤效应。结果H S CTL与自身LAK相比 ,CD3+,CD4+和CD8+细胞明显增多 ,抗肿瘤效应明显增强。结论采用淋巴细胞和肝癌细胞混合培养同时应用白细胞介素可获得大量扩增的高活性的H S CTL。