应用酵母单杂交系统筛选CpG免疫激活序列的特异性结合蛋白

目的 :寻找与 Cp G免疫激活序列 (imm unostimulatory sequence,ISS)有选择性相互作用的蛋白 ,以进一步探讨其分子作用机制。 方法 :采用酵母单杂交系统 ,以 4重复的 ISS为“诱饵”,对人骨髓细胞 c DNA文库进行初步筛选 ,并对部分阳性克隆以电泳迁移率变动分析 (EMSA )进行验证。结果 :已获得 4个双阳性克隆 ,其中两个编码功能未知的蛋白 ,而另外两个均属抗体轻链 ,分别与抗 DNA抗体和抗乙肝表面抗原抗体 (HBs Ab)高度同源 ;EMSA发现 HBs Ab可在偏酸 p H条件下 (p H6 .4和 5 .8时 )特异性地与含 ISS的寡核苷酸 (Cp G- ODN)结合。 结论 :HBs Ab可与

叶酸受体阳性肿瘤细胞对Folate-PGA偶联酶的特异性结合

目的考察叶酸受体阳性肿瘤细胞对叶酸偶联的青霉素G酰化酶(Folate-PGA)的特异性结合。方法采用Iodo-gen法标记的125I-Folate-PGA测定叶酸受体表达阳性FR(+)HeLa与SKOV3细胞以及叶酸受体表达阴性FR(-)A549细胞于4℃对Folate-PGA偶联酶的结合。结果125I-Folate-PGA对FR(-)A549无特异性结合;与HeLa和SK-OV3细胞的特异性结合的Kd分别为0.11nmol·L-1和0.25nmol·L-1。结论叶酸偶联的PGA酶对FR(+)肿瘤细胞具有较好的亲和力和靶向性,可用于叶酸导向的酶前体药物疗法的进一步研究。

肝癌细胞特异性结合抗体的筛选及序列测定

目的 通过噬菌体展示技术筛选与肝癌细胞特异性结合的抗体。方法 用肝癌细胞系SMMC772 1免疫小鼠 ,提取脾细胞总RNA ,构建单链抗体库 ,从中筛选特异性结合的抗体。结果 构建了一个库容量为 2× 10 5的单链抗体库 ,并筛选到 1个与肝癌细胞系HepG2特异性结合的噬菌体 单链抗体。此单链抗体与HepG2细胞结合滴度比正常肝细胞低 12 5倍以上。结论 本研究成功构建了单链抗体库并筛选到与靶细胞特异性结合的噬菌体 单链抗体。

应用噬菌体肽文库筛选mAbF3特异性结合肽(英文)

目的 应用噬菌体展示肽文库筛选可与汉坦病毒囊膜蛋白中和性单抗 (mAb)F3特异性结合的配体肽。方法以F3mAb为筛选配基 ,对噬菌体展示的随机 12肽文库进行 3轮生物亲和淘选 ;用夹心ELISA和竞争ELISA鉴定筛选克隆的结合特性 ,并进一步对阳性克隆进行序列测定和分析。结果 通过 3轮生物淘选 ,能被抗体捕获的噬菌体克隆为 2 1/ 2 2。ELISA测定显示 ,筛选到的噬菌体短肽能与F3mAb特异性结合。序列分析表明 ,7个阳性克隆氨基酸序列相同 ,均为 MHGPTKNQMWHT ;同源性分析显示 ,该序列与HTNV/SEOVM蛋白G2区第 75 0～ 75 9位氨基酸有较高的同源性。结论 本研究为基于表位水平的HFRSV特异性分子多肽疫苗的设计提供了重要的依据分析。结果 通过 3轮生物淘选 ,能被抗体捕获的噬菌体克隆为 2 1/ 2 2。ELISA测定显示 ,筛选到的噬菌体短肽能与F3mAb特异性结合。序列分析表明 ,7个阳性克隆氨基酸序列相同 ,均为 MHGPTKNQMWHT ;同源性分析显示 ,该序列与HTNV/SEOVM蛋白G2区第 75 0～ 75 9位氨基酸有较高的同源性。

对虾白斑综合症病毒与虾鳃细胞膜特异性结合关系的确立

对虾白斑综合症病素养(White spot syndrome virus,WSSV)是养殖对虾的一个主要病原,也是目前发现的基因组最大的动物病素养(基因组约290kDa,双链环状).

利用体内噬菌体展示技术筛选及鉴定肺癌特异性结合肽

目的利用体内噬菌体展示技术筛选并鉴定与肺癌特异性结合的多肽。方法用肺癌细胞A549接种裸鼠复制荷瘤动物模型,将随机肽库尾静脉注入裸鼠体内,循环15 min后取肿瘤组织中结合的噬菌体,如此进行3轮体内筛选后挑取噬菌体克隆,ELISA初步鉴定噬菌体克隆对肺癌细胞的亲和力、特异性。将阳性噬菌体克隆扩增、测序获得外源多肽氨基酸序列,化学方法合成多肽,鉴定多肽对肺癌细胞和组织的亲和力、特异性。结果ELISA结果显示,随机挑选的20个噬菌体单克隆中,1个对A549具有很强亲和力。测序获得多肽,命名为zp2。化学合成多肽zp2。竞争抑制、细胞免疫荧光和组织免疫荧光实验结果表明多肽zp2与肺癌细胞A549及肺癌组织特异性结合。结论利用体内噬菌体展示技术筛选出与肺癌细胞A549特异性结合的多肽,为肺癌诊断及治疗药物的研制奠定基础。

噬菌体展示技术筛选人乳腺髓样癌细胞特异性结合肽

目的利用噬菌体随机七肽库体外筛选与人乳腺髓样癌Bcap-37细胞特异性结合的小分子多肽。方法培养人乳腺髓样癌Bcap-37细胞作为靶细胞,人正常乳腺上皮细胞MCF-10A为吸附细胞,将噬菌体展示随机七肽库与人乳腺髓样癌Bcap-37细胞进行减性体外筛选,用ELISA法鉴定噬菌体对人乳腺癌Bcap-37细胞的亲和力。提取亲和力较高的单克隆噬菌体DNA,测定DNA序列并翻译出相应的氨基酸序列,进行同源性分析。结果利用噬菌体随机七肽库通过4轮减性筛选获得了与人乳腺髓样癌Bcap-37细胞特异结合的小分子多肽。ELISA法表明,第1,3,5,6,8,12,14,16,17,18和20号单克隆噬菌体与人乳腺髓样癌Bcap-37细胞有很强的亲和力和特异性。测序结果显示,重复性最高的序列为LXRNTNX。结论利用噬菌体展示技术体外筛选获得了能与人乳腺癌Bcap-37细胞特异性结合的小分子多肽LXRNTNX,经检索该肽段与已知蛋白尚无同源性,因此它很有可能成为乳腺癌的早期诊断和靶向治疗新的靶点。

老年乳腺癌组织雌激素受体、孕激素受体与富集AT序列的特异性结合蛋白1及人表皮生长因子受体-2表达的相关性

目的探讨老年乳腺癌组织中雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)与富集AT序列的特异性结合蛋白(SATB)1及人表皮生长因子受体(Cerb B)2表达的相关性。方法回顾性分析原发性乳腺癌患者172例的临床资料。以距肿瘤组织超过5 cm外的癌旁组织为对照,用免疫组化方法检测乳腺癌组织中SATB1、CerbB2表达及其与临床病理特征、ER、PR的关系。结果 SATB1、CerbB2在乳腺癌组织中表达的阳性率显著高于癌旁组织(P<0.05)。组织学分级Ⅲ级的乳腺癌组织中SATB1、CerbB2表达阳性率最高,其次为Ⅱ级、Ⅰ级,差异有统计学意义(P<0.05);临床分期为Ⅲ期的乳腺癌组织中SATB1、CerbB2表达阳性率显著高于Ⅰ+Ⅱ期(P<0.05);有淋巴结转移的乳腺癌组织中SATB1、CerbB2表达阳性率显著高于无淋巴结转移者(P<0.05)。SATB1、CerbB2在乳腺癌组织中的表达与ER、PR表达呈显著负相关(r_(ER)=-0.387,-0.372,r_(PR)=-0.296,-0.329,均P<0.05)。结论 SATB1、CerbB2在老年乳腺癌组织中呈高表达,且与ER及PR表达呈显著负相关。

丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶特异性结合肽的筛选和鉴定

丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶在病毒复制和包装中的重要作用使其成为特异性抗病毒药物研究的首选靶标。根据丝氨酸蛋白酶晶体结构特点 ,用柔性连接子连接NS3丝氨酸蛋白酶结构域和NS4A的核心序列 ,构建成单链丝氨酸蛋白酶基因并且在大肠杆菌中获得高水平的可溶性表达 ,纯化后的目的蛋白能够切割重组蛋白底物NS5ab。随后 ,以单链丝氨酸蛋白酶为靶分子对噬菌体展示的随机十二肽库进行了三轮淘筛 ,挑选的 44个克隆中有 3 7个克隆能够特异性地结合丝氨酸蛋白酶 ,并且这种结合作用为竞争性ELISA试验结果所支持。对 1 3个克隆进行序列测定 ,得到 6种序列 ,它们在氨基酸组成上存在明显偏性 ,富含组氨酸和色氨酸 ,缺乏酸性氨基酸 ;

RGD特异性结合多肽与重组改构人肿瘤坏死因子融合基因的克隆表达及其抑瘤活性

目的构建RGD多肽与重组改构人肿瘤坏死因子融合基因,进一步提高rmhTNF的临床疗效。方法应用基因重组技术构建了CRGDC与rmhTNF的融合基因,在E.coliDH5α中诱导表达重组蛋白RGDrmhTNF,采用溶菌酶法裂解菌体,裂解上清经硫酸铵沉淀、阴阳离子交换层析纯化后,用S180荷瘤小鼠模型和L929细胞体外杀伤实验测定纯化的重组蛋白RGDrmhTNF的体内、外杀伤活性。结果正确构建了编码RGDrmhTNF融合基因,重组工程菌升温诱导后以部分可溶形式表达RGDrmhTNF,纯化后纯度为96.88%,体外对L929细胞杀伤作用的比活性为3.6×108IUmg,与rmhTNF相当(3.0×108IUmg)。在S180荷瘤小鼠模型中,当RGDrmhTNF剂量为12×105IUkg时,对肿瘤的生长抑制率为84.9%,显著高于相同剂量的rmhTNF(肿瘤抑制率为59.09%,P<0.01)和环磷酰胺组(肿瘤抑制率为71.21%,P<0.01)。结论重组蛋白RGDrmhTNF可以提高rmhTNF的治疗效果。

肺癌细胞特异性结合肽的体内筛选及初步鉴定

目的筛选能与肺癌细胞特异性结合的多肽并初步鉴定其亲和力和特异性。方法用人肺癌细胞A549使裸鼠致瘤,尾静脉注射肽库。取荷瘤鼠的肿瘤组织,用体内噬菌体展示技术进行筛选;经过3轮体内筛选,获得在肿瘤组织中富集的噬菌体;利用ELISA和细胞免疫化学DAB染色法初步鉴定各克隆亲和力、特异性;对阳性克隆行DNA测序,利用生物信息学对此多肽进行分析、比对。结果随机挑选的10个单克隆中,8个均对A549细胞具有较高亲和力,其中3号克隆亲和力最高,其可特异性结合肺癌细胞A549和NCI-H1299,且对A549的亲和力强于NCI-H1299。DNA测序结果显示该序列与美国国立生物技术信息中心(NCBI)GenBank DNA序列数据库和Swiss-Prot蛋白数据库中的已知基因和蛋白无同源性。结论筛选出了能与肺癌细胞特异性结合的多肽。

68Ga-PSMA-I&T与前列腺癌细胞特异性结合的研究

目的:合成前列腺特异性膜抗原(PSMA)靶向诊断药物68Ga-PSMA-I&T并探讨其与前列腺癌LNCaP细胞特异性结合。方法:合成68Ga-PSMA-I&T,检测其标记率、放化纯及稳定性。用2-PMPA和68Ga-PSMA-I&T与LNCaP细胞竞争性结合,计算不同时间点细胞的放射性摄取值。用不同浓度PSMA-I&T和68Ga-PSMA-I&T与LNCaP细胞竞争性结合,计算细胞的放射性摄取值。进行68Ga-PSMA-I&T在ICR小鼠体内生物分布实验,计算每克组织放射性摄取值。对ICR小鼠和LNCaP荷瘤鼠行68Ga-PSMA-I&T micro-PET/CT动态显像,绘制时间放射性摄取值曲线。切除荷瘤鼠的肿瘤组织进行免疫化学染色,观察PSMA的表达情况。结果:68Ga-PSMA-I&T标记率为(95.4±2.5)%,放化纯大于99%,体内外稳定性好。结合组、阻断组反应30 min、90 min时细胞放射性摄取值分别为(3.3±0.5)%、(10.2±0.4)%、(0.99±0.03)%和(1.54±0.05)%(P<0.001),PSMA-I&T的半抑制浓度(IC50)为38.64nmol/L。荷瘤鼠68Ga-PSMA-I&T micro-PET/CT动态显像示15 min肿瘤组织已有明显放射性摄取,并且肿瘤组织的放射性摄取随时间延长逐渐增加。免疫化学染色结果显示LNCaP荷瘤鼠离体肿瘤组织表达丰富的PSMA蛋白。结论:68Ga-PSMA-I&T合成过程简便易行,标记率和放化纯高,稳定性好;68Ga-PSMA-I&T能与LNCaP细胞特异性结合,体内分布良好,是理想的前列腺癌靶向诊断示踪剂。

表面等离子共振测定CD45-FITC抗体与蛋白A特异性结合常数

运用表面等离子共振(SPR)平台建立测定CD45-FITC抗体与蛋白A特异性结合常数的方法。当偶联蛋白A的传感芯片上流过CD45-FITC抗体溶液时,双通道SPR仪实时监测CD45-FITC抗体与蛋白A特异性结合过程,获得了该反应不同温度下的结合速率常数k_a、解离速率常数k_d和结合平衡常数K_a,以及该反应的活化能E_a和焓变△H。结果表明该特异性结合比较适宜的条件是:中性或微碱性、较高的离子强度和较高的温度。该方法操作步骤简单、快速、灵敏度高、消耗样品少,是研究分析免疫球蛋白IgG抗体和蛋白A等生物分子相互作用比较理想的方法之一。

肺癌血清中特异性结合多肽的筛选

目的以肺癌血清从噬菌体展示肽库中筛选出能够用于血清学筛查和肺癌病理分型的多肽。方法利用M13噬菌体随机12肽展示肽库对24例临床确诊肺癌患者的血清和24例体检者的血清进行4轮吸附-洗脱的筛选。挑取筛选后的噬菌体单克隆,皆以血清和细胞株进行试验,选出特异性及确诊率较高的单克隆。目标单克隆通过DNA测序确定其所表达的多肽序列,进而人工合成带FITC标记的多肽,以肺癌细胞、正常肺细胞和肺癌组织切片进行荧光成像检测。结果随机挑取30个经过4轮筛选的噬菌体单克隆,通过血清和细胞株的试验,筛选出6个特异性和确诊率较高的单克隆,其中单克隆ZZ-8肺癌血清确诊率达到41.6%,且鳞癌的比例较高。ZZ-8经DNA测序分析,确定其表达的多肽序列为:APTPSTQMNLLP。FITC标记的多肽在细胞和组织切片的荧光成像检测中,均显示良好的特异性。结论人工合成的多肽ZZ-8能够为研发肺癌诊断试剂奠定基础。

人前列腺癌细胞特异性结合短肽在人体组织的分布

目的观察人前列腺癌转移相关蛋白结合短肽在人体各组织的分布,为进一步探讨前列腺癌的可能转移机制提供实验证据,为该短肽在前列腺癌抗肿瘤导向治疗的应用提供形态学依据,探讨该短肽在未来临床应用的潜能。方法收集尸检标本12例,含正常人体组织16种,前列腺活检标本11例。通过免疫组织化学方法系统地鉴定此特异性短肽在人体各种组织、器官的分布以及在前列腺增生时前列腺组织中的表达情况。结果人前列腺癌细胞转移相关蛋白的特异性结合短肽与被覆上皮、肌组织、神经组织、结缔组织无结合;与大多数腺上皮无结合,但与胰岛细胞亲和阳性率为50%、胃底腺壁细胞亲和阳性率为60%;在良性前列腺增生时无表达,但在PC-3M细胞膜上有阳性表达。结论该短肽可与前列腺癌细胞表面特异性蛋白结合,而与大部分人体正常组织无结合,具有良好的特异性,证明该短肽具有临床应用的潜能。

肝癌特异性结合肽的筛选及鉴定

目的 探讨利用噬菌体随机肽库筛选肝癌细胞特异性结合多肽或肝癌细胞优势结合多肽的可行性。方法 ①利用噬菌体随机十二肽库 ,对人肝癌细胞系HepG2和人正常肝细胞系L0 2进行 4轮差异筛选、富集 ,获得与肝癌细胞亲和的噬菌体克隆。②用酶联免疫吸附测定 (ELISA)法测定其与肝癌细胞、正常肝细胞的亲和力 ,进一步筛选出高度亲和肝癌细胞的特异性阳性噬菌体克隆。比较其与其他肿瘤细胞的亲和力。③提取阳性噬菌体DNA并进行DNA序列测定 ,获得与肝癌细胞亲和的多肽序列。④用免疫荧光共聚焦成像进一步确定展示阳性多肽序列的噬菌体与肝癌细胞的结合部位。⑤根据筛选的多肽序列合成十六肽WH16 ,利用竞争抑制实验鉴定其与肝癌细胞的结合。结果 筛选及ELISA结果示得到与肝癌细胞特异性结合并内化入肝癌细胞的噬菌体克隆 ,测序结果示 5 6 6 7%的被检噬菌体展示相同的多肽序列FLLEPHLMDTSM ,推测FLEP是肝癌细胞特异性结合肽的基序。免疫荧光共聚焦成像进一步确定展示序列FLLEPHLMDTSM的噬菌体与肝癌细胞特异性结合并内化入细胞内。竞争抑制实验示WH16能有效抑制展示序列FLLEPHLMDTSM的噬菌体克隆与肝癌细胞的结合。结论 利用噬菌体随机肽库获得能与肝癌细胞特异性结合的多肽序列FLLE PHLMDTSM 。

PC-3M细胞特异性结合短肽在人体组织结合情况与意义

目的观察人前列腺癌PC-3M细胞特异性结合短肽的在人体各种组织中的结合情况,为该短肽在前列腺癌抗肿瘤导向治疗的应用提供形态学依据,探讨该短肽在未来临床应用的潜能。方法用免疫组织化学染色方法鉴定此结合短肽的配体蛋白在人体各种组织、器官的分布情况。结果该特异性结合短肽与被覆上皮、肌组织、神经组织、结缔组织无结合;与大多数腺上皮无结合,但与胰岛细胞亲和阳性率为40.0%、胃底腺壁细胞亲和阳性率为50.0%。结论该短肽具有良好的特异性,证明其具有临床应用的潜能。

大肠杆菌12KD膜蛋白与526 bp oric DNA的特异性结合

Jacob,F.等(1)提出的复制子(replicon)假说中,认为细菌染色体是与细胞外膜(cell envelopes)相接触的,这种接触对于子代染色体的分离和染色体复制的控制起重要作用。近年来,有些实验室研究证实,在大肠杆菌中染色体DNA复制起始点(oric)区段是一个重要的接触点。

骨肿瘤细胞特异性结合肽修饰固体脂质纳米粒的肿瘤靶向性研究

目的制备骨肿瘤细胞特异性结合肽—SLT肽修饰的固体脂质纳米粒(SLT peptide modified solid lipid nanoparticles,SLT-SLNs),研究其与人骨肉瘤MG63细胞的亲和力和肿瘤靶向性。方法细胞摄取实验研究肿瘤细胞对SLT-SLNs的摄取。构建骨肿瘤裸鼠异位模型,研究不同固体脂质纳米粒的体内靶向性。结果 SLT-SLNs的平均粒径为(115.7±8.7)nm,多分散性系数为0.12,Zeta电位为(13±2.25)mV。细胞摄取实验结果显示MG63细胞对SLT-SLNs的摄取效率是SLNs的4.4倍(P<0.01);体内活体成像实验结果显示SLT-SLNs组荷瘤裸鼠肿瘤组织的荧光强度明显强于SLNs组。结论 SLT肽修饰的固体脂质纳米粒具有良好的骨肉瘤细胞亲和力,是一种潜在的高效骨肿瘤靶向给药系统。

利用体内噬菌体展示技术筛选膀胱癌特异性结合肽

目的:利用体内噬菌体展示技术筛选与人膀胱移行细胞癌特异性结合的小分子多肽。方法:将人膀胱移行细胞癌细胞BIU87接种于裸鼠体内,制备膀胱癌荷瘤小鼠模型,尾静脉注射噬菌体展示环七肽库,然后筛选与膀胱移行细胞癌特异性结合的含外源多肽的噬菌体,经过3轮体内筛选后,免疫组织化学法及ELISA法鉴定单克隆噬菌体对BIU87的亲和力。提取阳性单克隆噬菌体单链DNA进行测序,并推导出外源多肽氨基酸序列,化学合成多肽、制备分子探针后采用激光扫描共聚焦显微镜术及流式细胞术鉴定多肽对膀胱癌细胞和组织的特异性。结果:3轮体内筛选后,噬菌体富集率达到4.334×102倍。免疫组化结果显示,肿瘤组织中噬菌体肽的含量随着每一轮筛选呈增长趋势,且结合逐渐增强,同时由于噬菌体经肝、肾代谢,可见肝脏结合大量非特异性的噬菌体。ELISA结果显示,随机挑选的30个单克隆噬菌体斑中,有24个阳性噬菌体,其中10个噬菌体对BIU87有较强的亲和力,对其测序并推导出3种多肽序列,重复率最高的序列CSSPIGRHC(8/10)命名为NYZL1。化学合成FITC-C6-NYZL1,通过激光扫描共聚焦显微镜术、流式细胞术均证明多肽NYZL1可以特异性结合膀胱癌细胞。结论:利用体内噬菌体展示技术筛选出了与人膀胱移行细胞癌特异性结合的小分子多肽NYZL1,为膀胱癌早期诊断和靶向治疗提供一定的理论依据。