人前列腺癌细胞特异性结合短肽在人体组织的分布

目的观察人前列腺癌转移相关蛋白结合短肽在人体各组织的分布,为进一步探讨前列腺癌的可能转移机制提供实验证据,为该短肽在前列腺癌抗肿瘤导向治疗的应用提供形态学依据,探讨该短肽在未来临床应用的潜能。方法收集尸检标本12例,含正常人体组织16种,前列腺活检标本11例。通过免疫组织化学方法系统地鉴定此特异性短肽在人体各种组织、器官的分布以及在前列腺增生时前列腺组织中的表达情况。结果人前列腺癌细胞转移相关蛋白的特异性结合短肽与被覆上皮、肌组织、神经组织、结缔组织无结合;与大多数腺上皮无结合,但与胰岛细胞亲和阳性率为50%、胃底腺壁细胞亲和阳性率为60%;在良性前列腺增生时无表达,但在PC-3M细胞膜上有阳性表达。结论该短肽可与前列腺癌细胞表面特异性蛋白结合,而与大部分人体正常组织无结合,具有良好的特异性,证明该短肽具有临床应用的潜能。

PC-3M细胞特异性结合短肽在人体组织结合情况与意义

目的观察人前列腺癌PC-3M细胞特异性结合短肽的在人体各种组织中的结合情况,为该短肽在前列腺癌抗肿瘤导向治疗的应用提供形态学依据,探讨该短肽在未来临床应用的潜能。方法用免疫组织化学染色方法鉴定此结合短肽的配体蛋白在人体各种组织、器官的分布情况。结果该特异性结合短肽与被覆上皮、肌组织、神经组织、结缔组织无结合;与大多数腺上皮无结合,但与胰岛细胞亲和阳性率为40.0%、胃底腺壁细胞亲和阳性率为50.0%。结论该短肽具有良好的特异性,证明其具有临床应用的潜能。

骨肉瘤细胞特异性结合短肽的筛选

目的获得与骨肉瘤细胞株os-732特异结合的短肽,作为骨肉瘤靶向治疗的先导化合物。方法以骨肉瘤细胞os-732为靶细胞,成骨细胞为吸附细胞对噬菌体12肽库进行差减筛选,用细胞ELISA、免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果经三轮筛选,从随机挑选的20个噬菌体克隆中得到9个能特异性与骨肉瘤细胞os-732结合,而不与正常成骨细胞结合的阳性克隆。但其氨基酸序列无同源性。结论得到多个序列不同的特异性结合骨肉瘤的噬菌体克隆,提示骨肉瘤细胞表面结构复杂,具多个骨肉瘤抗原表位。本实验获得的短肽具有一定的亲合力和肿瘤特异性,为针对不同位点的靶向药物设计提供了实验依据。

人卵巢癌细胞特异性结合短肽的原核表达及靶向性分析

目的通过原核表达的方式制备人卵巢癌HO8910细胞株特异性结合短肽(ovarian cancer specific binding peptide 1,OSBP-1)和氨基酸顺序重排的短肽(scrambled peptide,OSBP-S),探讨其对卵巢癌HO8910细胞的靶向特异性。方法构建pGEX-6P-3/OSBP-1与pGEX-6P-3/OSBP-S原核表达载体,转化大肠埃希菌BL21(DE3),进行GST融合蛋白的诱导表达和纯化,纯化后的融合蛋白经SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析无误后,进行融合蛋白的酶切及小分子肽Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定,N端进行FITC标记。通过细胞免疫荧光和竞争性结合实验分析OSBP-1对人卵巢癌HO8910细胞株的靶向性,以及这种靶向性是否与特定的氨基酸顺序有关;通过亲和性试验研究OSBP-1与其他卵巢癌细胞、不同组织来源的肿瘤细胞及正常细胞的亲和性。结果成功构建了pGEX-6P-3/OSBP-1与pGEX-6P-3/OSBP-S原核表达载体;纯化后的融合蛋白经SDS-PAGE分析显示,出现单一的GST-OSBP-1和GST-OSBP-S蛋白条带;蛋白质印迹法分析证明,融合蛋白能被GST单克隆抗体识别;小分子肽Tricine-SDS-PAGE表明,成功获得OSBP-1和OSBP-S;标记后的FITC-OSBP-1与FITC-OSBP-S经高效液相色谱技术和质谱分析,纯度均>95%。细胞免疫荧光实验显示,FITC-OSBP-1对HO8910细胞有很强的结合能力,能进入细胞内显示很强的绿色荧光,但其与正常卵巢上皮细胞仅个别细胞显示绿光荧光,而FITC-OSBP-S与HO8910细胞和正常卵巢上皮细胞均显示很弱的绿色荧光。另外,随着FITC-OSBP-1浓度的增加,HO8910细胞的荧光强度增强;竞争性结合实验显示,FITC-OSBP-1与HO8910细胞的结合能力随着OSBP-1浓度的增加而下降,平均荧光强度(mean fluorescent intensity,MFI)递减,分别为0.140±0.002 1、0.062±0.001 5、0.027±0.002 0和0.009±0.001 5,差异有统计学意义(F=3 111,P<0.001),而加入不同浓度OSBP-S的MFI无明显变化,分别为0.142±0.004 2、0.142±0.005 7、0.139±0.002 5和0.138±0.001 5,差异无统计学意义,F=0.874,P=0.494;亲和性试验结果显示,FITC-OSBP-1与人卵巢癌HO8910细胞的MFI为0.157 4±0.001 1,明显大于FITC-OSBP-S阴性对照组0.006 2±0.000 5(t=219,P<0.001),与正常卵巢上皮细胞的MFI0.002±0.000 3,明显小于FITC-OSBP-S阴性对照组0.006 3±0.000 5(t=13.462,P<0.001),而与其他卵巢癌细胞OVCAR3、SKOV3、不同组织来源的肿瘤细胞LOVO、HepG2及正常细胞293T的MFI与FITC-OSBP-S阴性对照组分别比较,差异均无统计学意义,P>0.05。结论通过原核表达的方式成功制备OSBP-1和OSBP-S,证实OSBP-1对卵巢癌HO8910细胞具有浓度依赖性和氨基酸序列特异性靶向结合能力,且OSBP-1对正常卵巢上皮细胞几乎没有亲和力,对其他肿瘤细胞及正常细胞293T仅有很弱的亲和力,为卵巢癌的靶向治疗提供了理想的载体。