副粘病毒F1蛋白胞外非保守区对其特异性膜融合的影响

为了解融合蛋白F1分子的胞外非保守区在融合蛋白(F)与血凝素-神经氨酸酶(HN)的特异性膜融合中的作用,采用基因定点突变方法,在新城疫病毒(NDV)F1与人副流感病毒(hPIV)F1基因的胞外非保守区进行定点突变,创造酶切位点,得到分别含3个相同酶切位点的突变株NDV-M和hPIV-M。经检测,突变体的细胞融合功能与野毒株相同。然后用3个限制性内切酶分别从NDV-M与hPIV-M中切出两个片段NDVF-1、F-2及hPIVF-1、F-2。NDV-M和hPIV-M相互交换对应的F-1片段后进行基因重组,得到2个嵌合体(Chimera),即NDV-C1和hPIV-C1;同样方法交换F-2片段后又得到2个嵌合体NDV-C2和hPIV-C2。将各种嵌合体DNA与同源及异源HN基因共转染BHK21细胞后,在真核细胞中表达。Giemsa染色和指示基因法检测细胞融合功能,荧光强度分析(FACS)检测F蛋白的表达效率。结果表明,突变体NDV-M和hPIV-M的细胞融合功能与野毒株相同,可用于构建嵌合体。NDV-C1和NDV-C2分别与NDVHN共表达后,融合功能达到野毒株的76.34%和96.2%,与hPIVHN共表达后均无细胞融合发生;hPIV-C1和hPIV-C2分别与hPIVHN共表达后,融合功能达到野毒株的65.82%和93.78%,与NDVHN共表达后无细胞融合发生。FACS分析表明,突变体及所有嵌合体蛋白F的表达效率与野毒株相比均没有明显变化。实验结果说明在F1蛋白的胞外非保守区中,NDVF-1和hPIVF-1这两个片段对于NDV和hPIV的特异性膜融合具有重要作用;而NDVF-2和hPIVF-2这两个片段对于NDV和hPIV的膜融合来讲,则特异性较低。

副粘病毒F蛋白HR1和HR2在特异性膜融合中的作用

目的了解副粘病毒融合蛋白(F)分子上的七肽重复序列(HR1、HR2)在特异性膜融合中的作用。方法采用基因定点突变方法,在新城疫病毒(NDV)F与人副流感病毒(hPIV)F基因上创造相同的酶切位点。酶切后采用基因重组方法将F的HR1基因片段相互交换,得到交换HR1的两个嵌合体(chimera),即NDV C-HR1和hPIV C-HR1。用同样的方法又得到交换HR2的两个嵌合体,即NDV C-HR2和hPIV C-HR2。将各种嵌合体DNA与同源及异源HN DNA共转染BHK21细胞后,在真核细胞中表达。Giemsa染色和指示基因法检测细胞融合功能,荧光强度分析(FACS)检测F蛋白的表达效率。结果交换HR1后,NDV C-HR1的融合功能只有野毒株的53.91%,hPIV C-HR1的融合功能达到野毒株的83.15%;交换HR2后,NDV C-HR2的融合功能略高于野毒株,达到野毒株的107.23%,hPIV C-HR2的融合功能却只有野毒株的12.01%。FACS分析表明,交换HR1后的NDV C-HR1和hPIVC-HR1的表达效率均下降。交换HR2后,NDV C-HR2的表达效率没有改变,而hPIV C-HR2的表达效率下降。结论NDV F的HR1对其特异性膜融合具有重要作用,而HR2则没有病毒特异性;hPIV F的HR1和HR2对hPIV的特异性膜融合都有重要作用。

猪源新城疫病毒F蛋白裂解位点对BHK-21细胞特异性膜融合的影响

目的研究猪源新城疫病毒F蛋白裂解位点区氨基酸序列对其特异性膜融合作用的影响。方法采用基因定点突变及基因重组的方法,测定突变猪源新城疫病毒JL01株F蛋白裂解位点区基因序列,并将阳性突变质粒与猪源新城疫病毒HN基因共转染BHK-21细胞,通过面积判断法和细胞计数法分析细胞融合效率。结果突变株RF4细胞融合效率为0.58±0.10,与野毒株的0.55±0.02接近。RF5融合效率较高,为0.69±0.05;RF3融合效率较低,为0.25±0.02。结论猪源新城疫病毒F蛋白裂解位点的改变对其特异性膜融合作用有一定影响。