口蹄疫重组鸡痘病毒诱导猪特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性检测

目的:评价口蹄疫重组鸡痘病毒vUTAL3CP1诱导猪产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性的能力。方法:用PCR方法亚克隆O型FMDVVP1基因C末端部分片段(第1 30～2 1 3AA)。将其插入真核表达载体pDisplay中,构建质粒pDisplay- mVP1。将pDisplay -mVP1转染PK 1 5细胞,经3次G41 8加压筛选,并用RT- PCR和IFA鉴定,证明获得表达目的基因的PK 1 5 /pDisplay- mVP1细胞。最后,利用该细胞作为靶细胞,用LDH法检测口蹄疫重组鸡痘病毒vUTAL3CP1免疫猪的特异性CTL杀伤活性。结果:vUTAL3CP1免疫组在效靶比2 5∶1和5 0∶1时,CTL裂解活性分别达到42 . 84%±3 2. 1 %和61 . 94%±4 2. 8% ,显著高于灭活疫苗组与其它对照组(p <0 . 0 1 )。结论:vUTAL3CP1可以诱导猪产生高水平的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性,为进一步的FMDV基因工程疫苗的研究奠定了基础。

肝癌细胞抗原致敏树突状细胞体外诱导特异性细胞毒T淋巴细胞

目的:探讨原发性肝癌患者外周血树突状细胞(DC)体外经自体肝癌细胞抗原致敏后,对特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL) 的诱导作用. 方法:肝癌患者外周血经梯度密度离心法分离,获得DC前体细胞,用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM- CSF)和重组人白介素-4(rhIL-4)联合培养,诱导扩增DC. 制备自体肝癌细胞抗原,体外脉冲DC,检测DC诱导自体T细胞增生能力及特异性CTL在体外对自体肝癌细胞的杀伤活性. 结果:经自体肝癌细胞抗原致敏的DC能诱导较强的自体T 细胞增生,且能诱导特异性CTL,该CTL,对自体肝癌细胞具有很强的杀伤活性,杀伤率明显高于DC、未经肝癌细胞抗原致敏的DC激活的CTL及T淋巴细胞的杀伤率,而对CT26细胞、BEL-7402细胞无明显的杀伤作用. 结论:肝癌患者外周血DC体外能诱导高效而特异的抗肝癌免疫,提示DC可能在肿瘤治疗及预防其复发与转移中发挥重要作用.

自然杀伤细胞和神经元特异性烯醇化酶及T淋巴细胞亚群在新生儿化脓性脑膜炎外周血中的表达及临床意义

目的探讨自然杀伤细胞(NK)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)及T淋巴细胞亚群(CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)、CD4^(+)/CD8^(+))在新生儿化脓性脑膜炎外周血中的表达及临床意义。方法选取2021年10月至2022年12月赣州市妇幼保健院收治的30例化脓性脑膜炎患儿作为观察组,另选取30名同期出生的健康新生儿作为对照组。两组于入组后次日清晨采集空腹静脉血,观察组治疗后10 d再次采集空腹静脉血。比较两组外周血NK、NSE与T淋巴细胞亚群(CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)、CD4^(+)/CD8^(+))水平。结果治疗前,观察组NK、CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)水平及CD4^(+)/CD8^(+)均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);治疗后,观察组NK、CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)水平及CD4^(+)/CD8^(+)均高于治疗前,差异有统计学意义(P<0.05),但与对照组比较差异无统计学意义。治疗前,观察组NSE水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);治疗后,观察组NSE水平低于治疗前,差异有统计学意义(P<0.05),但与对照组比较差异无统计学意义。ROC曲线分析结果显示,NK诊断价值最高,其次为CD3^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)、NSE、CD4^(+)和CD8^(+)。结论新生儿一旦罹患化脓性脑膜炎,会导致外周血中T淋巴细胞紊乱失调,T淋巴细胞免疫功能长时间处于抑制状态,促使脑神经受到不同程度损伤,而通过观察NK细胞、NSE及CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)在外周血中的表达,可为临床诊疗提供有力的参考依据,从而改善其免疫功能,有效控制病情,促进患儿病情康复。

妊娠期特异性beta1糖蛋白9 HLA-A3限制性细胞毒性T淋巴细胞表位的鉴定

目的:鉴定来自食管癌细胞中特异性高表达的妊娠期特异性beta1糖蛋白9(PSG9)的HLA-A3限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位。方法:首先运用RT-PCR方法检测PSG9mRNA在食管癌细胞EC9706、EC-1及EC-109中的表达情况。然后通过Bimas和Syfpeithi预测,再结合NetCTL1.2选取4条来源于PSG9的HLA-A3限制性的表位。候选表位P336的2位的氨基酸由异亮氨酸替换为亮氨酸,9位的氨基酸由酪氨酸替换为赖氨酸。候选表位P378的9位氨基酸由精氨酸替换为赖氨酸。候选表位通过标准的Fmoc化学法合成,通过结合力实验检测表位与T2A3细胞表面HLA-A3分子的结合力水平,通过细胞毒实验检测对EC-1细胞毒活性。结果:PSG9在肿瘤细胞EC9706、EC-1以及EC-109中都有表达。候选表位P107、P201和P336-2L9K与HLA-A3分子有弱结合力,P336、P378和P378-9K与HLA-A3分子有中等结合力。细胞毒实验结果显示P336-2L9K、P378和P378-9K对EC-1细胞均有一定的杀伤作用。结论:多肽P336-2L9K、P378和P378-9K能诱导体外抗肿瘤免疫反应,有可能成为PSG9阳性肿瘤细胞的共同CTL表位。

丙型肝炎病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞功能的研究

目的研究慢性丙型肝炎患者丙型肝炎病毒(HCV)特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的功能及其与临床疾病状态的关系。方法表达HCV核心蛋白的真核表达质粒pcDNA3.1-core通过Lipofecta-mineTM基因转染法转染HepG2细胞,经G418筛选获得稳定转染HepG2细胞(Hep-core),经Western blot证实有HCV核心蛋白表达;分离患者外周血单个核细胞,经体外诱导扩增获得HCV特异性CTL(HCV-CTL),以Hep-Core细胞和HepG2细胞作靶细胞,乳酸脱氢酶释放法检测HCV-CTL活性,用酶联免疫吸附法检测培养上清液中干扰素-γ(IFN-γ)含量,以正常人作为对照。结果慢性丙型肝炎患者组HCV-CTL活性值为(23.9±4.8)%,明显低于对照组(42.6±6.5)%(t=7.22,P=0.011)。高病毒载量组HCV-CTL活性值(18.9±4.8)%,明显低于低病毒载量组的(33.7±3.2)%(t=8.22,P=0.003);基因1型患者HCV-CTL活性值(20.8±2.1)%明显低于基因2或3型的(32.4±2.5)%(t=11.7,P=0.001);ALT升高患者HCV-CTL活性值(29.3±3.1)%与ALT正常患者(25.7±3.4)%相比无统计学差异(t=0.93,P>0.05)。慢性丙型肝炎患者培养上清液中的IFN-γ量(957±241)pg/ml明显低于对照组的(3117±673)pg/ml(t=8.87,P=0.001)。结论慢性丙型肝炎患者HCV-CTL活性降低,CTL的免疫功能低下与病毒水平和基因型相关而与ALT水平无关。

EBV特异性细胞毒性T淋巴细胞体外诱导培养及杀伤效果鉴定

本研究旨在探讨EB病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞(EBV-CTL)体外诱导和扩增培养的方法,并检测其特异性杀伤的效果。采集EBV血清抗体阳性的6例正常供体的外周血单个核细胞(PBMNC),用EBV转化的B淋巴细胞系(BLCL)作为抗原递呈细胞及抗原刺激剂,经辐照灭活后不断刺激培养自体PBMNC,诱导产生EBV-CTL,并将其扩增培养;采用流式细胞仪鉴定其免疫表型,然后检测不同效靶细胞比例条件下EBV-CTL对自体BLCL(autoBLCL)、自体植物血凝素培养的B淋巴母细胞(PHA-blast)、HLA不合供体的BLCL(alloBLCL)、K562细胞株的杀伤效果。结果表明,6例EBV血清抗体阳性正常供体来源的PBMNC在体外成功筛选并扩增培养了EBV-CTL,扩增效率为PBMNC数的18.6-55.0倍。刺激10次培养后的EBV-CTL对autoBLCL在20∶1、10∶1、5∶1三种效靶细胞比例条件下特异性杀伤效率的平均值分别为59.4%、43.2%、29.0%;对PHA-blast、alloBLCL、K562的非特异性杀伤率在上述三种效靶细胞比例下平均值依次为7.1%、9.4%、10.3%(P<0.05),6.6%、8.3%、8.1%(P<0.05),5.4%、7.3%、6.3%(P<0.05)。结论:EBV-CTL能有效在体外筛选培养并扩增,并能有效杀伤HLA相合的BLCL,可望成为EBV相关性移植后淋巴细胞增殖性疾病的过继免疫治疗的有效方法。

HIV-1B亚型Nef core蛋白特异性T淋巴细胞免疫应答研究

研究表明,Nef蛋白通过激活CD4＋T淋巴细胞,提高病毒颗粒的感染性,增加CD4分子和主要组织相容性复合体（MHC）分子的内吞,以及防止受感染细胞凋亡等途径,对HIV复制起到极其重要的促进作用[1]。因此机体对Nef蛋白的免疫反应及其在控制病毒方面的作用成为人们所关注的问题。

特异性细胞毒T淋巴细胞治疗HCMV感染的研究进展

人巨细胞病毒 (HCMV)的感染是普遍的 ,所致的危害也很严重。目前药物防治已被普遍选择 ,尽管它能限制 HCMV感染的发展 ,但其副作用使临床把希望寄托于免疫预防和治疗。 HCMV的感染后果主要决定于宿主的免疫状况 ,其中特异性 CTL起着关键作用。大量资料已证明 ,HCVM特异性 CTL可用于预防和治疗HCMV的激活与疾病。

慢性HBV感染者特异性细胞毒性T淋巴细胞及HLA-A2的变化研究

目的:探讨慢性HBV感染者特异性细胞毒性T淋巴细胞(specific cytotoxic T lymphocyte,CTL)及人类白细胞抗原-A2(human leucocyte antigen-A2,HLA-A2)的变化,并分析CTL与血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)水平和病毒载量的关系,以了解慢性HBV感染者特异性细胞免疫功能的状态。方法:采用HLA-A2限制的HBVcore18-27抗原表位肽五聚体(MHC Pentamers)法结合流式细胞技术,分析CHB组慢性乙型肝炎46例、LC组乙型肝炎肝硬化29例和NC组23例正常对照健康体检者,外周血HBV特异性CTL及HLA-A2的变化,并分析CTL与ALT水平和病毒载量的关系。结果:CHB组、LC组HLA-A2检出率均明显高于NC组;ALT水平和病毒载量与HBV特异性的CTL有一定的关系。结论:采用HLA-A2限制的HBVcore18-27抗原表位肽五聚体(MHC Pentamers)法结合流式细胞技术可以检测到低水平的HBV特异性CTL;HLA-A2是乙型肝炎肝硬化的易感基因之一;ALT水平和病毒载量与HBV特异性CTL有一定的关系。

人类免疫缺陷病毒感染与特异性细胞毒性T淋巴细胞反应

特异性细胞毒性T淋巴细胞是一种能直接杀伤病毒及抗细胞内感染的效应细胞。大多数细胞毒性T淋巴细胞为CD8细胞,其反应是控制人类免疫缺陷病毒感染的重要免疫反应,但细胞毒性T淋巴细胞不能完全清除人类免疫缺陷病毒,这与病毒在体内的高度变异及病毒攻击人体免疫系统导致免疫功能改变有关。

转基因表达HBV抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞受体

目的通过逆转录病毒介导HBV抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)的T细胞受体(TCR)转基因表达,初步观察其结合活性。方法从HLA-A2阳性急性乙肝患者外周血中诱导、分选、克隆和扩增HBV抗原特异性CTL;提取细胞RNA,用RT-PCR、5'-RACE和OVER-LAP PCR等方法获取TCR的α和β链编码基因;构建TCR重组逆转录病毒,介导特异性TCR分别在人Jurkat T细胞和HLA-A2阳性健康人CD8 T淋巴细胞上表达。结果从1例HLA-A2阳性急性乙肝患者样本中分别获得了2组TCR Vα、Vβ配对,分别命名为α21β13、α15β13,包装的重组逆转录病毒滴度为(1.5～5.0)×105IU/mL,用针对目标TCR的特异性Vβ链抗体(抗Vβ13 TCR-PE)和HLA-A2限制性表位特异性五聚体(pentamer)进行免疫荧光染色,重组TCR在T细胞表面获得表达:其中在Jurkat细胞上转入的Vβ13链表达细胞占1.06%～2.25%,在HLA-A2阳性健康人T细胞上Vβ13阳性细胞和pentamer阳性细胞分别占到1.03%～2.06%和1.05%～1.12%,在HLA-A2阴性健康人T细胞上Vβ13阳性细胞和pentamer阳性细胞均低于0.05%。结论通过逆转录病毒介导可以使HBV特异性CTL TCR获得转基因表达,具有结合HLA-A2限制性表位的活性。

人类免疫缺陷病毒感染中的特异性细胞毒T淋巴细胞反应(二)

(接上期) 2.4粘膜中的细胞免疫由于HIV主要是通过性接触传播,病毒通过粘膜入侵机体,对于暴露部位局部的免疫功能的研究也是目前的一个热点.现在认为粘膜处抗HIV免疫反应主要有以下特点[9]:(1)经典的粘膜免疫反应是由特异性IgA介导的,但在HIV感染中,对病毒env特异性的IgG在口腔、鼻粘膜及生殖道处占了优势.但是,由于这类特异抗体并无中和保护作用,其出现于疾病的进展无一定的联系.(2)与体内其它部位相似,细胞免疫是粘膜处抗HIV的主要免疫反应.CTL反应对控制病毒数量起决定作用.(3)由于HIV在粘膜处的传播主要是通过嗜巨噬细胞毒株来实现的,妇女在暴露后仅有一部分入血.可能是由于这个原因,生殖道粘膜中的CTL反应可识别的病毒表位谱较血中窄,具有更强的限制性.(4)在人类唾液腺中存在一种称为唾液白细胞蛋白酶的抑制因子.该因子在体外可以有效地控制HIV,同时,在唾液中HIV通常呈阴性,这说明该物质可以有效地抑制HIV通过口腔粘膜传播,其机制可能是妨碍病毒与靶细胞的接触.

慢性荨麻疹患者血清特异性IgE和T淋巴细胞检测

目的:分析慢性荨麻疹的致病因素以及细胞免疫功能的改变。方法:采用免疫印迹法体外半定量检测血清特异性IgE,采用流式细胞仪双色直接免疫荧光法分析T淋巴细胞亚群。结果:305例慢性荨麻疹患者中109例患者至少对一种过敏原呈阳性反应,阳性率为35.74%,57例健康献血员的特异性IgE检测全部为阴性,两组比较差别有统计学意义(χ2=22.95,P<0.05)。在18种常见变应原的检测中发现,户尘螨的阳性率最高,达13.77%,而且中重度过敏者(Ⅲ级以上)达4.92%。结论:慢性荨麻疹的病因复杂,部分患者是由于接触变应原引起的I型变态反应,同时伴有T淋巴细胞免疫功能紊乱。

人类免疫缺陷病毒感染中的特异性细胞毒T淋巴细胞反应(一)

特异性细胞毒T淋巴细胞(Cytoxic T Lymphocyte,CTL)是一类可以杀伤表达特异性抗原靶细胞的T细胞亚群.CTL是抗细胞内感染(病毒、单核细胞增多性李斯特菌等)、急性同种异型移植物排斥反应和杀伤肿瘤的重要效应细胞[1].

ITP血小板特异性抗体和T淋巴细胞亚群及NK细胞变化的意义探讨

目的:检测特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者抗血小板膜糖蛋白(GPIIb/Ⅲa、GPIb/Ⅸ)特异性抗体表达、T淋巴细胞亚群及NK细胞的变化,探讨相关因素在ITP发病机制中的作用。方法:应用改良血小板抗原单克隆抗体固相化检测技术(MAIPA)、流式细胞术分别检测52例ITP和24例正常对照组抗血小板膜糖蛋白(GPIIb/Ⅲa、GPIb/Ⅸ)特异性抗体表达、T淋巴细胞亚群及NK细胞变化。结果:ITP组的血小板计数明显低于正常对照组(P<0.05);抗GPⅡb/Ⅲa及GPIb/Ⅸ抗体A值均高于正常对照组(P<0.05);相关分析表明ITP组血小板计数与两种特异性抗体水平均呈负相关关系;在T淋巴细胞亚群变化中,ITP组CD3+T淋巴细胞百分比、CD4+T淋巴细胞百分比及CD4+/CD8+的比值均明显低于正常对照组(P<0.05),CD8+T淋巴细胞百分比则显著高于正常对照组(P<0.05);NK细胞百分比明显低于正常对照组(P<0.05)。结论:血小板特异性抗体及T淋巴细胞亚群的变化可较好地反映ITP这一病理过程,对提高诊断水平及指导临床有一定的实用价值。

特异性免疫治疗对支气管哮喘患儿血清调节性T淋巴细胞水平、IL-10、sIgE水平的影响及疗效评价

目的探讨特异性免疫治疗对支气管哮喘患儿血清调节性T淋巴细胞、IL-10、sIgE水平的影响,分析特异性免疫治疗对儿童哮喘的疗效。方法选取2017年2月至2018年4月贵州省贵阳市妇幼保健院儿童呼吸哮喘专科收治的支气管哮喘患儿60例,随机分为实验组和对照组,各30例。对照组患儿接受常规糖皮质激素吸入剂等基础用药治疗;实验组在基础用药治疗的同时给予特异性免疫(Specific immunotherapy,SIT)治疗。检测并对比CD4^+CD25^+T细胞、CD4^+CD25^high CD127^low Treg细胞占比变化,血清IL-10、sIgE水平变化。结果治疗前两组患儿咳喘发作次数与持续时间比较无显著差异(P>0.05);两组经过治疗1年后,患儿临床症状均明显改善;但实验组患儿平均咳喘次数、持续时间均明显低于对照组(P<0.05);治疗1年后两组CD4^+CD25^+T细胞、CD4^+CD25^high CD127^low Treg细胞、IL-10水平升高(P<0.05),实验组均高于对照组(P<0.05);1年后两组sIgE水平均下降,实验组均低于对照组(P<0.05)。结论对支气管哮喘患儿给予特异性免疫治疗可改善调节性T淋巴细胞水平,还可改善炎症因子、免疫指标水平,可改善哮喘临床症状,降低其复发率,有效缓解哮喘病情,随访观察一年疗效理想,值得推广。

荧光素标记检测乙型肝炎病毒表面抗原特异性杀伤性T淋巴细胞方法的探讨

用绿色荧光前体化合物CalceinAM标记靶细胞,经过与杀伤性T淋巴细胞(CTL)效应细胞数小时的孵育,通过分析培养上清中的荧光强度检测CTL效应。通过对一系列标记条件的研究:不同浓度CalceinAM标记靶细胞、不同洗涤缓冲液、不同标记细胞浓度、不同洗涤次数、不同裂解液配方,确定CalceinAM荧光素标记法的最佳条件。用该方法检测乙型肝炎病毒表面抗原的DNA疫苗免疫Balb/c小鼠对P815S细胞的CTL效应,E/T比为10时,杀伤效率接近饱和,达到65%。通过荧光显微镜直接观察杀伤后的P815S细胞,细胞破裂程度与计算出的杀伤效率有一定相关性。

自体与异体输血对颅脑损伤大骨瓣减压患者T淋巴细胞亚群及血清神经元特异性烯醇化酶的影响

探讨自体与异体输血对颅脑外伤大骨瓣减压患者T淋巴细胞亚群及血清神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)影响。结果表明颅脑外伤后自体输血较异体输血具有明显的优越性,不仅能减轻免疫抑制,而且有助于脑功能的恢复。