基于新型高保真Taq酶的多重等位基因特异性PCR方法的建立与应用

在8号染色体存在部分替换片段的小鼠上挑选3个SNP位点进行初步方案检验,包括高保真Taq酶的特异性测试以及引物浓度对分型结果的影响,并评价该方法的灵敏度;之后应用该技术检测野生1号染色体替换系小鼠上的9个SNP的不同样本。对Taq酶的特异性研究表明:引物在未引入突变的前提下检测结果与测序结果保持一致;引物稀释实验说明浓度最低为0.003~0.006μmol/L,灵敏度的检测结果表示最低浓度检测限可达0.07 ng/μL以下。最后检测得到5种标准样本的基因型,其代表9个SNP的组合。成功验证并建立该新型高特异性Taq酶应用于多重等位基因特异性PCR实验的总体流程。提供一套具备高特异性、能够针对多个SNP位点进行检测的低成本方案,对多重等位基因特异性PCR技术的开发同样具有参考价值。

基于等位基因特异性PCR技术检测Sw-5b基因

番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)是世界范围内危害最大的病毒病之一。为了加快番茄抗TSWV育种进程,利用等位基因特异性PCR(Allele-Specific PCR,AS-PCR)技术建立了与TSWV抗性基因Sw-5b连锁的标记。结果表明:在63℃退火温度下,引入A-C错配的特异性引物rg3-F可以检测出抗性基因型。没有引入错配的特异性引物sg1-F,在60℃退火温度下可以检测出感病基因型。在验证试验中,利用引物Sw5b-f1/r1进行PCR扩增并测序,结果表明利用rg3-F和sg1-F进行AS-PCR,能够有效区分番茄的不同基因型。本研究建立的AS-PCR方法为育种工作者在番茄抗TSWV育种中筛选Sw-5b抗性基因提供了有力的工具。

多重位点特异性PCR法同时鉴别牛膝和川牛膝配方颗粒

目的建立一种同时鉴别牛膝和川牛膝药材及配方颗粒的多重位点特异性PCR鉴别方法。方法通过比较牛膝属相近物种核基因ITS序列,设计牛膝和川牛膝的特异性引物,经过优化PCR反应体系及PCR反应条件,建立了牛膝和川牛膝配方颗粒的多重位点特异性PCR鉴别方法。结果在退火温度为58℃、循环次数为31时,牛膝和川牛膝配方颗粒分别可扩增出187 bp和164 bp的特异性条带。该方法对牛膝和川牛膝药材的掺伪检出限分别为1%、5%,对两者配方颗粒的掺伪检出限分别为10%、50%。结论所建立的多重位点特异性PCR鉴别可有效鉴别牛膝和川牛膝配方颗粒及其掺伪体系。

鳖甲配方颗粒的位点特异性PCR鉴别研究

目的:建立一种鳖甲配方颗粒特异性聚合酶链式反应(PCR)鉴别方法。方法:根据中华鳖Trionyx sinensis及其混伪品的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COXⅠ)基因序列,筛选出中华鳖的特异性单核苷酸多态性(SNP)位点,设计鳖甲鉴别专属引物BJ-5F及BJ-5R。通过优化PCR反应条件,确定最佳的PCR反应体系,并对该方法进行耐受性、适用性考察和测序验证。结果:当退火温度为60℃,循环33次时,鳖甲药材、标准汤剂冻干粉及配方颗粒均可在约236 bp处得到清晰单一的中华鳖条带,其混伪品及阴性对照品均无此条带。结论:该研究所建立的特异性PCR鉴别方法适用于快速鉴定鳖甲药材、标准汤剂冻干粉及配方颗粒的真伪,且具有专属性强、准确性高、简便易行等特点,为鳖甲配方颗粒质量标准的制定提供了参考依据。

紫苏属药用植物的rDNA ITS区SNP分子标记与位点特异性PCR鉴别

目的 分析单种属——紫苏属各变种间rDNA ITS区的序列以及存在的单核苷酸多态性（SNP）现象，设计出位点特异性PCR引物，用于紫苏属各变种间的分子标记鉴别。方法 对紫苏属各变种多个体的rDNA ITS区全序列进行了准确测定，运用Clustral X1．8，MEGA3．0进行排序并进行SNP分析，从而设计出鉴别各变种的等位基因位点特异性PCR鉴别引物。结果 紫苏属各变种（紫苏、白苏、鸡冠苏和耳齿紫苏等）的rDNA ITS区全序列共有615～618bp的长度，ITS1为233～235bp，5．8S为179bp，ITS2为203～204bp，GC含量为61．5％～61．9％。从rDNA ITS区碱基变异的整体情况来看，紫苏属各变种间不仅在非编码的转录间隔区ITS1和ITS2内存在非编码区单核苷酸多态性（ncSNP），而且在保守的5．8S编码区内也存在3个位点的单核苷酸多态性，即编码区SNP（cSNP），所有的SNP均只具2等位多态性。5．8S区cSNP的出现与产生该变异的变种出现的显著形态差异关联。本文还利用这些SNP位点设计出了鉴别紫苏属各变种的位点特异性PCR引物，无需测序即可对紫苏属的原植物及“苏子”、“苏叶”等药材进行有效准确的分子鉴别。结论 紫苏属药用植物rDNA ITS区存在的SNP可用作紫苏属各变种鉴别的分子标记。

齿瓣石斛的位点特异性PCR鉴别

目的 设计出齿瓣石斛的位点特异性鉴别引物 ,仅通过PCR就能完成对齿瓣石斛真伪进行准确鉴别。方法 根据齿瓣石斛及其他枫斗类、黄草类石斛的rDNAITS序列数据库 ,设计了齿瓣石斛的位点特异性PCR鉴别引物JB Chiban 0 1S和JB Chiban 0 1X。然后 ,对 38种石斛属植物模板DNA进行了PCR扩增 ,阳性者即为齿瓣石斛正品。结果 当退火温度设定为 5 8℃时 ,只有齿瓣石斛的模板DNA能被扩增出来 ,而其他的 37种石斛属植物均为阴性。该鉴别反应重复性好 ,已在鉴别齿瓣石斛时发挥重要作用。结论 运用位点特异性鉴别引物能成功地对齿瓣石斛进行PCR鉴别 ,与DNA测序鉴别方法相比 ,位点特异性PCR具有高效、准确、简便、省时等优点。

利用16S rDNA建立种特异性PCR快速检测鸭疫里默氏菌

鸭疫里默氏菌感染是危害养鸭业的主要疾病，用表型指标鉴定鸭疫里默氏菌存在不足，因此有必要建立检测该菌的种特异性PCR法。利用已登录的鸭疫里默氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌的16S rDNA基因序列，设计了一对鸭疫里默氏菌16S rDNA基因的特异性引物190f和843r，分别以基因组DNA和菌落提取液为模板，从1-19型鸭疫里默氏菌参考菌株和代表亚型、变异株和可能新型的国内分离株共26株细菌中均扩增出大小为654bp的特异性片段，而扩增鸭大肠杆菌、鸭沙门氏菌和禽多杀性巴氏杆菌等感染鸭的常见细菌的结果均呈阴性。分别将鸭疫里默氏菌基因组DNA和菌落提取液进行10倍梯度稀释，基因组DNA的最小检出量为50pg，菌落最小检出量为15CFU／mL。结果说明，该PCR法具有较好的特异性和敏感性，可用于快速鉴定鸭疫里默氏菌。

兜唇石斛的位点特异性PCR鉴别

根据兜唇石斛及其它37种枫斗类和黄草类石斛的rDNAITS序列,设计了鉴别兜唇石斛的位点特异性PCR引物DC JB01S和DC JB01X,并对兜唇石斛成功地进行了位点特异性PCR鉴别.在进行位点特异性PCR鉴别之前,首先运用扩增ITS区的通用引物P1、P2对模板DNA进行扩增,以验证模板的可靠性和扩增的合适浓度.当退火温度上升为64℃,只有兜唇石斛的模板DNA能被扩增出来,而其它的37种石斛属植物均为阴性.该鉴别反应重复性好,已在鉴别我国兜唇石斛中发挥重要作用.与DNA测序鉴别方法相比,位点特异性PCR具有简单、省时、高效、准确等优点.

鸡白痢沙门菌等位基因特异性PCR检测方法的建立

根据鸡白痢沙门菌与鸡伤寒沙门菌的rfbS基因在第237和第598位碱基的不同,设计和合成了等位基因特异性PCR引物,建立了快速检测鸡白痢沙门菌的PCR方法,并应用该方法对鸡白痢沙门菌临床分离样品进行了PCR鉴定。结果显示,该PCR方法能够特异性地鉴定鸡白痢沙门菌,检测灵敏度达100 pgDNA。对35个经常规方法鉴定的鸡白痢沙门菌分离株应用等位基因特异性PCR方法进行鉴定,鉴定出33株鸡白痢沙门菌,符合率为94.3%。表明,建立的等位基因特异性PCR方法能够准确而快速地鉴定鸡白痢沙门菌。

基于等位基因特异性PCR原理建立的SNP分型新方法

目的建立一种新方法,对多个单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)位点进行分型。方法基于等位基因特异性PCR原理,采用荧光标记复合扩增和毛细管电泳技术,根据PCR片段长度差异进行分型。选择SNP位点共11个,每个SNP位点设计两条长度不同、3’末端分别与SNP两个等位基因碱基配对的上游引物,同时为了增加特异性,在两条等位基因上游引物的3’末端第3或第4位碱基人为引入错配。在距离上游引物100～300bp范围内的合适位置,设计下游共用引物,并进行荧光标记。所有位点经过复合扩增后,PCR产物经ABIPrismTM310型遗传分析仪电泳分离,确定每个SNP的基因型。结果每个SNP位点纯合子为单一产物峰,杂合子则为长度不同的两个产物峰。不同的SNP位点扩增产物长度不同,根据产物长度和产物峰的数量进行SNP分型,一次完成11个SNP位点分型,其结果与直接测序完全一致。结论荧光标记复合扩增片段长度差异等位基因特异性PCR法是一种简单快速而有效的SNP分型新方法。

金钗石斛的位点特异性PCR鉴别研究

目的建立一种简便、实用的金钗石斛的DNA分子鉴别方法。方法根据金钗石斛及其他黄草类、枫斗类石斛的rDNA ITS序列数据库,寻找金钗石斛特异性的序列位点,设计专用于金钗石斛鉴别的PCR引物,用该引物在不同条件下扩增石斛属植物的模板DNA,建立只有金钗石斛具有阳性扩增的PCR鉴别条件。结果在66℃、40 s的复性条件下进行鉴别PCR,金钗石斛的模板DNA扩增出约300 bp的阳性扩增带,而其他39种石斛的模板DNA在同样条件下无扩增产物。结论运用位点特异性PCR能有效地从其他石斛属植物中鉴别出金钗石斛,该方法具有高效、准确、简便、省时的特点,应用前景广泛。

霍山石斛及相似种的位点特异性PCR鉴别

目的设计出霍山石斛的位点特异性鉴别引物,仅通过PCR就能对霍山石斛的真伪进行准确鉴别。方法利用石斛属植物基因库中rDNA ITS序列数据库进行同源性比较,在与霍山石斛差异较大的区段设计1对特异性引物,然后对19份石斛属植物DNA模板进行PCR扩增,阳性者即为霍山石斛正品。结果发现在退火温度为60℃时,该引物能把霍山石斛的模板从19份石斛属植物中扩增出来,而其他的石斛属植物均为阴性。结论运用位点特异性鉴别引物成功地对霍山石斛进行PCR鉴别,该鉴别反应重现性好,能在霍山石斛鉴别时发挥重要的作用,与形态学、DNA测序等鉴别方法相比,该方法具有高效、准确、简便、省时等优点。

簇毛麦基因组特异性PCR标记的建立和应用

以普通小麦中国春、簇毛麦、中国春 簇毛麦二体附加系和代换系为材料进行RAPD分析 ,筛选出一个簇毛麦基因组特异性RAPD片段OPF0 2 757,该片段分布于簇毛麦所有染色体上。在对OPF0 2 757进行克隆、测序的基础上 ,设计一对PCR引物 ,建立了簇毛麦基因组特异性PCR标记。用这对PCR引物对不同普通小麦品种、不同硬粒小麦品种、不同居群的簇毛麦、中国春 簇毛麦二体附加系、中国春 簇毛麦二体代换系、普通小麦 簇毛麦双二倍体、硬粒小麦 簇毛麦双二倍体等材料进行扩增 ,凡具有簇毛麦染色体的材料都能扩增出一条长为 6 77bp的DNA片段 ,而不具簇毛麦染色体的材料包括大麦、黑麦、长穗偃麦草、中间偃麦草等不能扩增出该片段。所以 ,该特异性PCR标记可用于快速跟踪检测小麦背景中的簇毛麦染色体。

甲基化特异性PCR方法诊断Prader-Willi综合征

目的Prader-Willi综合征(PWS)是多系统异常的复杂临床综合征,仅根据临床症状很难诊断,国外已建立快速、高效、特异性、敏感性均佳的甲基化特异性PCR(MS-PCR)方法用于临床诊断,但我国还未有系统的对照研究。该研究目的便是建立PWS的MS-PCR诊断方法,并对临床疑似患者进行筛查。方法将44例受试者,分为正常对照组(16例)、临床确诊患者组(7例)及临床疑似患者组(21例)。采用盐析法提取基因组DNA;应用CpGemoneTMFast Modification试剂盒行亚硫酸盐修饰;以正常人为阴性对照,未修饰的基因组DNA为系统对照,以M(母源)、P(父源)两对引物同时对修饰产物行PCR;扩增产物以琼脂糖凝胶电泳分离。结果①16例正常对照的PCR结果同时显示M,P两条带,7例临床确诊的PWS患者均只显示一条M带;②经MS-PCR筛查的21例临床疑似患者,2例确诊为PWS,其他19例排除PWS。结论该研究成功建立MS-PCR,并对疑似患者进行了筛查确诊。MS-PCR为特异高效的PWS确诊方法且方便易行。

光慈菇药材的特异性PCR鉴定

目的:研究光慈菇基原植物老鸦瓣及其混伪品特异性PCR鉴定的可行性。方法:基于ITS序列构建光慈菇及其混伪品的系统发育树,并在对ITS序列分析的基础上,为光慈菇设计了一对特异性PCR引物LYB-CP2s/LYB-CP2a,优选扩增条件,用于区别光慈菇及其混伪品。结果:在系统发育树中光慈菇聚类为一个单系。通过对PCR反应的退火温度、循环次数和DNA模板用量进行优化,并对不同型号的PCR仪和Taq酶进行考察,分别获得光慈菇的特异性PCR反应程序。在PCR产物中,正品出现目的条带,而混淆品不出现条带。结论:特异性PCR鉴别方法稳定性高,能够有效地区别光慈菇与其混伪品。

转基因大豆GTS40-3-2转化事件特异性PCR检测

GTS40-3-2是抗草甘膦转基因大豆,为建立GTS40-3-2大豆转化体特异性PCR检测方法,本研究以GTS40-3-2标准品为实验材料,根据已公布转基因大豆GTS40-3-2基因与大豆基因组连接序列信息,利用Primer5.0软件设计了5对品系特异性引物,对每对引物进行了退火温度、特异性及扩增效率的PCR检测,结果显示,5对特异性引物均能够从GTS40-3-2中扩增出大小约279bp、238bp、470bp、490bp和257bp的预期产物,可用于特异性检测转基因大豆GTS40-3-2转化事件。以转基因大豆GTS40-3-2含量为5%、2%、1%、0.5%和0.1%的标准品进行PCR灵敏度检测,结果表明5对引物的检测灵敏度均能达到0.1%。通过荧光定量PCR对5对特异性引物的Ct值与溶解曲线比较,最后选择出RRS2引物对为转基因大豆GTS40-3-2品系特异性检测的最适引物。本文结果将为我国未来转基因生物产品成分检测提供科学合理的实验参考。

球花石斛的位点特异性PCR鉴别研究

为建立球花石斛的DNA分子标记鉴别方法,本文根据测定及GenBank上登录的109种共计164个石斛样本的rDNAITS序列,设计了特异性鉴别引物QH-JB1和QH-JB2,并对球花石斛进行了位点特异性PCR鉴别研究。结果表明,当复性条件为63.5℃,1min时,只有球花石斛的模板DNA能被扩增出约300bp的阳性扩增带,而其他种石斛均为阴性。证明用本法鉴别球花石斛简便、省时,也适用于干燥球花石斛药材的鉴别,具有广泛的应用前景。

片段长度差异等位基因特异性PCR—一种改良的SNP分型新方法

目的建立一种基于等位基因特异性PCR原理的改良SNP分型新方法:片段长度差异等位基因特异性PCR,并考察特异性引物的3'端第3位、第4位碱基错配对特异性延伸的影响。方法以SNP位点rs759117和rs760887为例,设计两条长度不同、3'末端分别与SNP两个等位基因碱基配对的上游引物,同时在两个等位基因特异性引物3'端第3或第4位碱基引入错配以增加特异性,下游为公用引物。PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染显带后确定样本的基因型。结果不同SNP纯合子为长度不同的单一谱带,杂合子则为两条带,其结果与直接测序完全一致。两条特异性上游引物3'端第3或第4位碱基引入错配后非特异性延伸显著减少,且对PCR反应条件的严格性要求明显降低。结论片段长度差异等位基因特异性PCR是一种简单快速而有效的SNP分型新方法;两条特异性引物3'端第3。

等位基因差异特异性PCR检测HBVDNA的前C区1896突变位点及其临床意义

为了探讨ＨＢＶ前Ｃ区 １８９６突变位点检测的临床意义，采用３－末瑞等位基因差异特异性ＰＣＲ方法对９５例乙型肝炎病毒感染者的ＨＢＶＤＮＡ１ ８９６位点进行基因型（野生株／突变株）的检测，结果显示：总突变率为６４．２％，总野生率为５５．８％，纯野生型和纯突变型的检出率分别为２８．４％和２７．４％；不同临床类型的乙肝病毒感染者均可出现突变，其野生型、突变型和混合感染型的检出率之间的比较无显著性差异（Ｐ＞０．０５），急性乙肝与慢性乙肝、携带者、肝硬化和肝癌的总突变率存在差异（Ｐ＜０．０５）；血清不同ＨＢｅ系统均可发生突变．抗－ ＨＢｅ阳性组的突变率显著高于ＨＢｅＡｇ阳性和ＨＢｅ系统阴性组（Ｐ＜０．０５），提示：机体感染了ＨＢＶ后．变异主要是发生在慢性持续性感染过程中．突变株逐渐替代了野生株并成为优势株．使宿主得以持续感染ＨＢＶ。

用等位基因特异性PCR筛查海南省黎族人β-地中海贫血IVSII654(C→T)突变

目的:研究海南省黎族人群β-地中海贫血IVSII654(C→T)突变的发病率。方法:应用等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)技术筛查海南省白沙、昌江、陵水、琼中、保亭等县黎族人群中β-地中海贫血IVSII654(C→T)突变。结果:共筛查了788例黎族人DNA标本,未发现β-地中海贫血IVSII654(C→T)突变。结论:IVSII654(C→T)突变不是海南省黎族人群中主要的β-地中海贫血的基因类型。