应用特异等位PCR快速鉴定灰霉病菌抗苯莱特与乙霉威菌株

根据灰霉病菌Botrytis cinerea对苯并咪唑类（苯莱特）及N－苯氨基甲酸酯类（乙霉威）杀菌剂的抗性与其β－微管蛋白的198和200位密码子的单碱基突变紧密相关的原理，建立了一种同时检测灰霉病菌对这两类杀菌剂抗性表型的特异等位聚合酶链式反应（ASP,Allele-specific Polymerase Chain Reaction）方法，即将突变的单碱基作为正引物的3'末端，与之对应的未突变的单碱基作为负引物的3'末端， 自行设计了LP4～LP8等五个等位点特异性引物，应用包括这五个引物在内的七组引物，对生测为BenSNPCR、BenHRNPCS和BenHRNPCR菌株进行了ASP扩增，结果表明：该方法可以检测出相应抗药表型的菌株，并能有效地检测田间灰霉病菌的抗药性，从而该方法克服了生物检测方法费时和准确性差等缺点。该方法还能鉴定出生测法确定为同一表型如BenHRNPCR 中的BenSNPCR异核菌丝，或灰霉病菌侵染寄主后所产生的回复突变，因此其方法的灵敏度极高，可应用于灰霉病菌抗药性分子生态学机理研究和田间抗性菌株的快速鉴定。由于未发现BenMRNPCR型菌株，其适用性有待进一步验证。

利用多重等位基因特异PCR鉴别人参、西洋参

目的:查找并发现参类药材的SNP位点,利用多重等位基因特异PCR同时鉴别人参、西洋参。方法:查找GenBank上已收载的参类药材序列,进行比对分析,根据人参、西洋参的SNP位点设计引物,对PCR反应体系进行优选。在此基础上,对20个不同来源的人参、西洋参样品进行PCR扩增,根据各自的特异条带进行鉴别。结果:当退火温度为66℃时,出现249 bp条带的为人参,1 049 bp条带的为西洋参。该鉴别反应特异性高、重复性好,能在同一反应中准确鉴别人参、西洋参。结论:多重等位基因特异PCR能成功地对人参、西洋参进行鉴别,在中药材分子鉴定中具有推广应用价值。

油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因BnALS1R等位基因特异PCR标记的开发与应用

油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因BnALS1R是从抗性突变体M9中克隆获得,抗性基因BnALS1R与野生型基因BnALS1存在1处SNP,即乙酰乳酸合酶第638位丝氨酸残基被天冬酰胺酸替代。为获得油菜抗除草剂基因BnALS1R的分子标记,根据该处点突变,结合获得的BnALS3与BnALS1序列,开发30条等位基因特异PCR(allele-specific PCR,AS-PCR)引物,采用筛选出的3条AS-PCR引物在F2、BC1和BC2群体中进行PCR扩增。结果表明,该标记有效检测出群体中存在的3种基因型,其分离比分别为1∶2∶1、1∶1、1∶1,均遵循单基因遗传规律。应用该标记对获得的抗性恢复系进行PCR扩增,结果发现所有抗性恢复系均能扩增出抗性基因BnALS1R目的条带,表明3条标记引物可应用于抗性基因的检测。AS-PCR标记的获得将促进以抗性基因进行油菜抗除草剂分子标记辅助选择育种。

用等位基因特异PCR检测普通小麦(Triticum aestivum L.)的单核苷酸多态性

【目的】以2份六倍体小麦Opata85和W7984及其重组近交系(RIL)的111个株系和3份小麦二倍体野生近缘种为材料,研究用等位基因特异PCR检测普通小麦中单核苷酸多态性的方法。【方法】利用直接测序的方法检测2份六倍体小麦和3份小麦二倍体野生近缘种TaDREB1基因的DNA序列,在B基因组上发现了2个SNPs。以其为3′端,设计等位基因特异引物及其互补引物,对SNP进行分型,同时研究了特异引物3′端碱基错配对等位基因特异PCR的影响,优化了PCR反应体系。【结果】等位基因特异引物3′端不同位置的碱基错配及不同类型的碱基错配对PCR结果影响较大;在等位基因特异PCR中,Mg2+、dNTP及TaqDNA聚合酶的用量均大于普通PCR。【结论】只要在等位基因特异引物3′端加上合适的错配碱基,并且优化其PCR反应体系,用等位基因特异PCR方法检测六倍体小麦中的单核苷酸多态性是可行的。

利用等位基因特异PCR鉴别虎掌南星及其部分混淆品

目的:建立中药材虎掌南星的分子鉴定方法,为天南星药材质量控制提供依据。方法:GenBank中下载半夏属、天南星属、犁头尖属物种的叶绿体rpl20基因序列,利用DNAMAN进行比对分析,发现半夏属和虎掌南星的SNP位点,并设计鉴别引物Ptrpl94F,Ptrpl708R和Pprpl148F,Pprpl484R,采用等位基因特异PCR方法对虎掌南星、半夏、水半夏3个物种的10个样品进行扩增。结果:引物Pprpl148F和Pprpl484R仅对虎掌南星扩增333 bp条带,半夏、水半夏均无扩增,能准确鉴别虎掌南星。引物Ptrpl94F和Ptrpl708R对半夏、虎掌南星均扩增611 bp条带,水半夏无扩增。结论:本实验建立的等位基因特异PCR方法能准确区别出虎掌南星和半夏、水半夏,为虎掌南星及半夏的正确用药提供了保障。

等位基因特异荧光PCR法检测CYP2C19基因型

目的了解人群CYP2C19基因型的分布,评价等位基因特异荧光PCR法检测CYP2C19基因型。方法等位基因特异荧光PCR法和金标准Sanger DNA直接测序法检测356名供者外周血CYP2C19基因型,实验采用同步盲法。结果 CYP2C19*1/*1型、CYP2C19*1/*2型、CYP2C19*2/*3型、CYP2C19*3/*3型、CYP2C19*2/*2型及CYP2C19*1/*3型的频率分布:使用PCR荧光法检测时分别为46.6%(166/356)、33.2%(118/356)、2.0%(7/356)、0.8%(3/356)、10.7%(38/356)及6.7%(24/356);采用DNA测序法时分别为46.3%(165/356)、33.4%(119/356)、2.0%(7/356)、0.8%(3/356)、11.0%(39/356)及6.5%(23/356)。两种方法检测CYP2C19基因型具有一致性(P=0.392),且一致性较好(Kappa=0.987);两种方法基因型检测结果一致率为99.2%。结论为保障医疗安全,临床需开展CYP2C19基因型检测;等位基因特异荧光PCR法检测CYP2C19基因型简便可靠。

基于等位基因特异性PCR原理建立鸡白痢沙门氏菌PCR方法

根据鸡白痢沙门氏菌与鸡伤寒沙门氏菌的rfbS基因在第237和598位碱基的不同,设计和合成等位基因特异性PCR引物,建立快速检测鸡白痢沙门氏菌的PCR方法,并应用该法对鸡白痢沙门氏菌临床分离样品进行了PCR鉴定。结果显示,该PCR方法能特异性地鉴定鸡白痢沙门氏菌,检测灵敏度达18 pg/μL DNA,4.7×104CFU/mL菌液,表明建立的等位基因特异性PCR方法能准确而快速地鉴定鸡白痢沙门氏菌。

等位基因特异PCR检测N-乙酰化转移酶遗传多态性研究

目的与方法 :改良一种适用于流行病学研究的N 乙酰化转移酶 (NAT2 )基因型的等位基因特异PCR(AS PCR)检测方法 ,分析了 3个NAT2基因突变点 :481T、5 90A、85 7A ,并用此法对 76例南京地区健康人群的NAT2基因型多态性进行了研究。从而也检验了该方法。结果 :该人群中各基因频率 :Wt(野生型 )为 0 .5 72 3:481T为 0 .0 395 ;5 90A为 0 .2 36 8;85 7A为 0 .15 13。与白种人比较差异有显著性 ,而与文献报道的亚州人群频率分布特征基本一致。结论 :南京地区健康人群中与快反应相关的NAT2基因型占多数 (82 .9% ) ;本文改良的AS PCR检测方法经验证为NAT2基因多态性研究的有效实验手段。

等位基因特异PCR结合熔解曲线分析快速检测线粒体DNA A1555G突变

目的建立一种线粒体DNA A1555G突变的快速检测方法。方法以45例线粒体耳聋患者为研究对象,采用等位基因特异PCR结合熔解曲线分析对线粒体DNA A1555G突变位点进行检测,根据得到的熔解曲线分析线粒体DNA A1555G突变。并与PCR产物直接测序法结果进行比较。结果线粒体DNA A1555G同质性突变时只出现一个峰且峰尖所对应的Tm为(82±0.5)℃;线粒体DNA A1555G未发生突变时只出现一个峰且峰尖所对应的Tm为(79±0.5)℃;线粒体DNA A1555G异质性突变时出现2个峰且各自峰尖所对应的Tm为(82±0.5)℃和(79±0.5)℃。45例样本的检测结果与PCR产物直接测序法的结果符合率达100%。结论等位基因特异PCR结合熔解曲线分析具有操作简便、结果准确、快速等特点,可作为线粒体DNA A1555G突变检测的常规方法。

等位基因特异多重PCR快速检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性研究

了解北京地区异烟肼(INH)耐药结核分枝杆菌(MTB)的分子特点,评价等位基因特异多重PCR在INH耐药性快速检测中的应用价值。选取102株北京地区MTB临床分离株,首先分别采用PCR-RFLP和反向线性杂交技术(RLB)检测耐药相关基因katG和inhA突变,然后运用等位基因特异多重PCR方法同时检测katG和inhA基因突变,并与PCR-RFLP和RLB分别检测的结果进行比较。采用等位基因特异多重PCR检测发现,INH耐药株中60.3%(35/58)存在katG315突变,13.8%(8/58)发生了inhA突变,两者同时突变率为6.9%(4/58),INH敏感株中没有发现katG315突变,而inhA突变率为18.2%(8/44)。上述检测结果与PCR-RFLP和RLB分别检测的结果完全一致,且等于两种方法结果之和,提示等位基因特异多重PCR可完全取代PCR-RFLP和RLB。北京地区INH耐药菌株以katG315 AGC→ACC突变为主;联合检测katG315和inhA基因可提高INH耐药株的检出率。等位基因特异多重PCR操作简便,结果易于判断,可作为临床MTB菌株中INH耐药性快速检测的辅助手段。

双向等位特异PCR技术及其在单核苷酸多态性研究中的应用

目的:建立双向等位特异PCR体系,并将其应用于单核苷酸多态性(SNP)研究工作。方法:通过美国国家生物信息中心(NCBI)的Genbank获取基因序列及其相应位点的SNP信息。利用Primer 5.0软件设计引物,并经NCBI的Blast2.0软件检验其特异性。双向等位基因特异性引物PCR(Bi-PASA PCR),将该技术应用于与张力蛋白在10号染色体上同源缺失的磷酸酶(PTEN)基因SNP的研究。结果:证实该技术具有较高的可靠性和优越性。结论:双向等位特异PCR技术是一种简便、特异性较高、费用低廉和便于推广的SNP检测方法,特别是在群体基因SNP研究中更有优势。

双向等位基因特异性PCR技术在杏SNP分型上的应用

【目的】建立一种基于单碱基突变的双向等位基因特异PCR(bi-directional PCR amplification of specific alleles,Bi-PASA)技术,并将其应用于杏单核苷酸多态性分型研究。【方法】利用直接测序的方法在2份不同果肉质地杏EXP基因的DNA序列上发现1个单碱基变异。在其上、下游两端设计双向等位基因特异性引物及其外侧互补引物,对120份杏材料的SNP进行分型。同时,对部分材料的基因型进行测序验证。【结果】利用双向等位基因特异PCR对杏EXP基因315 bp处SNP分型结果与直接测序完全一致。【结论】双向等位基因特异PCR技术是一种简单、经济、快速而可靠的SNP分型方法,可有效地应用于杏基因组上已知SNP突变的分型研究。

CYP17基因多态性等位基因特异性PCR检测方法的建立

目的建立快速准确检测CYP17基因单核苷酸多态性的新方法。方法用等位基因特异PCR(AS-PCR)方法对53例外周血标本CYP17基因单核苷酸多态性位点rs743572进行基因分型。结果 AS-PCR测定结果与聚合酶链式反应-限制性片断长度多态性方法(PCR-RFLP)的测定结果一致。结论采用AS-PCR检测CYP17基因多态性准确、快速。

等位特异PCR方法检测IL-6基因启动子区-634C/G多态性

目的:应用等位特异PCR法检测IL-6启动子区-634位C/G变异,以探讨ASPCR应用的可行性.方法:应用ASPCR法和PCR-RFLP法同时检测101例研究对象IL-6启动子区-634位C/G变异的多态性,并对二者的结果进行比较研究.结果:(1)除一个CC基因型结果不一致外,其余的CG、GG和CC基因型两种方法的结果都一样;(2)ASPCR在单点突变多态性的检测中,具有省时、快速和成本低等优点.结论:APCR方法检测基因的已知突变,具有快速、准确、省时、价格低等优点,在满足引物模板间碱基错配能阻止引物延伸的条件下,可优先选用此法.

等位特异PCR检测FOXC2检测基因多态性实验方法研究

目的研究等位特异PCR方法检测FOXC2基因5’非编码区512C／T多态性的实验条件。方法对实验研究中的主要影响因素设置各系列浓度梯度，进行PCR反应后观察电泳结果选取最适条件。结果最适温度为58℃，最适Mg^2＋浓度为3．0mmol/L，最适dNTP浓度为2．5mmol／L。结论摸索最适实验条件是进行批量实验的前提和关键。

等位基因特异PCR技术的研究与应用

生物的单核苷酸多态性(Single-nucleotide polymorphism,SNP)具有数量多、分布广、易于分型、稳定性强等优点,很适合于用做分子标记。等位基因特异PCR(Allele-specific PCR,AS-PCR)是根据SNP位点设计3′末端与SNP位点碱基互补或错配的特异PCR引物,通过凝胶电泳等方法检测PCR扩增产物的有或无,从而检测基因型中SNP的一种技术。经过不断地改进与完善,基于SNP的等位基因特异PCR标记已逐渐成为一种快速、简便、低成本、可靠、高通量的检测基因型SNP的方法。本文应用等位基因特异PCR技术,根据小麦TaDREB1基因在旱选10和鲁麦14的120(C→A)SNP成功地开发了一个SNP分子标记,证明了该方法的有效性和可行性。

一种检测细胞微量点突变的方法——等位基因特异的PCR

为了灵敏、方便地检测出细胞群体中含量极低的点突变 ,利用一 β珠蛋白基因簇Gγ 2 0 2C→G突变的杂合细胞株 ,优化传统的等位基因特异PCR的反应条件 ,以定量的PCR产物为模板 ,在含 5 %甲酰胺的体系中用半巢式的等位基因特异引物进行扩增 .结果表明 ,该方法灵敏可靠 ,可快速检测到细胞群体中低于 0 0 2 5

竞争性特异等位基因PCR检测山东甜菜夜蛾对高效氯氰菊酯的抗性

为明确山东地区甜菜夜蛾对高效氯氰菊酯抗性水平,采用竞争性特异等位基因PCR方法,检测甜菜夜蛾钠离子通道基因片段上L1014F的突变频率。结果表明,敏感种群个体中均未发现突变个体;田间章丘种群92%个体具有L1014F突变,其中64%为L1014F突变纯合子,28%为L1014F突变杂合子。经高效氯氰菊酯汰选5代后的抗性种群检测个体中均未发现敏感型纯合子。安丘种群的L1014F突变等位基因频率最高,为85%,泰安、滕州和滨州种群分别为50%、43.33%和30%,相关性分析表明甜菜夜蛾L1014F突变等位基因频率与对高效氯氰菊酯不敏感度呈线性正相关(Y=1.106x+0.079,R2=0.93)。

等位基因特异PCR结合测序检测CYP21A2基因突变的方法

目的建立一种等位基因特异PCR结合测序检测CYP21A2基因突变的方法。方法通过对CYP21A2基因和相应假基因CYP21AP序列进行同源性比较，同时设计等位基因特异PCR引物与可扩增CYP21A2和CYP21A2P基因的同源性引物。选择4例先天性肾上腺皮质增生症患者和5名正常对照，比较等位基因特异PCR引物与同源引物测序结果。结果等位基因特异PCR引物扩增和测序分析结果显示，4例患者均存在突变，分别为IVS2—13A／C〉G、Arg356Trp和Arg149Pro，对照序列正常。同源引物扩增分析只能明确Arg149Pro突变，患者和正常对照均存在IVS2—13A／C〉G和Arg356Trp突变。结论等位基因特异PCR技术结合测序可简便可靠地进行CYP21A2基因突变检测，具有临床应用推广价值。

水稻稻瘟病抗性基因Bsr-d1功能标记的开发和利用

稻瘟病是危害水稻最严重的病害之一,选育抗病品种是防治该病害最有效的方法。Bsr-d1是对稻瘟病菌具有广谱抗性的一个重要基因。为提高Bsr-d1基因在育种中的选择效率,根据Bsr-d1与其感病等位基因bsr-d1在功能区域存在的单核苷酸差异,设计和筛选出Bsr-d1基因不同类型的基因功能标记CAPs5-1和3Bsr-d1/3bsr-d1,结合测序分析验证,可准确鉴定出Bsr-d1的不同基因型。利用3Bsr-d1/3bsr-d1对34份籼稻品种、江苏历年来主要推广的110份粳稻品种、其他省份的13份粳稻品种、148份太湖流域地方粳稻资源和19份太湖流域地方籼稻资源进行了Bsr-d1基因型检测,筛选到携带Bsr-d1基因的籼型资源11份,271份粳型资源中均不携带Bsr-d1基因,这也说明Bsr-d1主要分布在籼型水稻资源中,在粳型资源中几乎不存在。本研究为Bsr-d1基因的育种利用和分子标记辅助选择奠定了基础。