大鼠胃经沿线特异组织结构与“循经取穴”关系的研究

目的:根据大鼠胃经沿线特异组织结构和针刺镇痛经络效应的相关性探讨其与“循经取穴”针刺作用的关系。方法:在大鼠胃经沿线特异组织结构上选择包括“后三里”在内的3个针刺位点,分别进行针刺前后痛阈测定,并与特异组织结构旁2个对照位点针刺前后的痛阈进行比较,同时对不同针刺位点特异组织结构上镇痛效应物质含量进行放免检测对比。结果:在胃经沿线特异组织结构上3个位点针刺前后痛阈变化明显,在特异组织结构旁2个对照位点上针刺前后痛阈未见有意义改变。针刺“后三里”与针刺特异组织结构旁2个对照位点的胃经沿线特异组织结构上β-内啡肽(β-EP)、强啡肽(DynA)含量差异显著。结论:正常大鼠胃经沿线特异组织结构具有激发针刺效应的特异性。

PolⅡ型启动子K14实现组织特异RNAi

RNAi(RNA interference,RNAi)是继基因打靶技术后的一种高效的研究基因功能的方法。细胞学实验和小鼠模型的研究结果表明,PolⅡ型启动子可以实现组织特异的RNA干扰,从而为鉴定基因在特定组织中的功能及作用机理提供了一个强有力的研究方法。为了能将这种方法用于转基因绵羊生产,探讨基因与绵羊毛囊发育的关系及其作用机制等,文章利用PolⅡ型CMV启动子和毛囊组织特异表达的人角蛋白14(K14)基因的启动子驱动eGFP-shRNA融合转录本的生成,从而实现敲低目的基因的表达。体外基因表达沉默效率分析(pEGFP-C1-shRNA和psiCHECK-BMP4双质粒共转染Hela细胞)结果表明,6个干扰序列均能有效地抑制BMP4基因的表达,抑制效率达到60%以上;体内表达沉默分析(只转染pEGFP-K14-shRNA质粒转染小鼠皮肤细胞系JB6-C41)的实验结果与体外分析结果相似,除3#序列外,其余干扰序列对BMP4基因的抑制效率都在60%以上,其中5#序列的效率达到80%以上。siRNA诱导的目标基因沉默中mRNA和蛋白水平的下降显著正相关。结果表明,设计构建的由PolⅡ型启动子K14驱动eGFP-shRNA融合转录本的形成,从而实现RNAi的研究方法是可行的,利用这种方法可以实现在特定细胞中敲低目的基因的表达水平。为在大家畜特别是绵羊中应用RNAi的方法分析目的基因在毛囊发育、对不同类型毛囊生长发育的诱导和调节等作用机理的研究提供一个参考方法。

中华稻蝗羧酸酯酶家族基因生物信息学及组织表达特异性分析

[目的]对重要农业害虫中华稻蝗(Oxya chinensis)羧酸酯酶(carboxylesterases,Ces)家族基因进行生物信息学分析,并对部分基因的组织表达特性进行研究,为揭示中华稻蝗Ces基因功能及研发新的分子靶标提供依据。[方法]基于中华稻蝗转录组数据库,通过关键词搜索获得Ces基因序列,采用生物信息学方法进行比对拼接、氨基酸序列推导和开放阅读框分析,选择全长序列构建系统发育树,采用在线软件分析中华稻蝗Ces氨基酸序列结构、理化性质、信号肽和N糖基化位点等特征。采用实时定量PCR技术,通过ge Norm与Normfinder软件分析4个候选内参基因β-肌动蛋白(β-actin)、延长因子(EF1α)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)和核糖体蛋白49(RP49)表达稳定性,筛选中华稻蝗5龄若虫不同组织部位最适内参基因并检测10个羧酸酯酶基因在不同组织部位相对表达量。[结果]从中华稻蝗转录组数据库搜索获得Ces基因c DNA片段180个,经筛选获得28个Ces基因全长序列进行生物信息学分析。推导的氨基酸序列与其他昆虫物种的聚类分析结果显示,中华稻蝗28个Ces分布于4个功能簇中,其中A簇直翅目和部分双翅目昆虫α酯酶(20个)、D簇表皮特异酯酶(2个)、E簇β酯酶(4个)和F簇非鳞翅目保幼激素酯酶(2个)。氨基酸序列分析结果显示,中华稻蝗大部分Ces的等电点(p I)均为偏酸性或弱酸性,p I为4.38—6.84,只有3个Ces的p I值偏碱性。中华稻蝗所有的Ces基因都具有N糖基化位点、N端保守的半胱氨酸残基及氧离子洞,信号肽预测结果表明19个Ces具有完整的信号肽;21个Ces具有典型的催化三联体S-E-H,其余7个Ces催化三联体发生了不同的替换。Ge Norm与Normfinder分析结果显示,4个候选内参基因稳定性EF1α=RP49>β-actin>GAPDH。选择EF1α作为内参基因,RT-q PCR结果显示10个羧酸酯酶基因在7个不同组织部位均有表达,其中OcCesA1、OcCesA6、OcCesA12、OcCesA14、OcCesA18和OcCesA19在中肠和胃盲囊高表达,此外OcCesA6、OcCesA18和OcCesA19还在马氏管高表达,OcCesA2在后肠高表达。OcCesD1在马氏管表达量最高,脂肪体和表皮次之;OcCesE1在胃盲囊表达量最高;OcCesF2在中肠表达量最高。[结论]基于中华稻蝗转录组数据库获得28个全长Ces基因,聚类分析结果显示,这些基因分布于4个功能簇中,其中分布于A簇的基因数目相对较多,且多在中肠、胃盲囊和马氏管等代谢解毒器官中高表达。研究结果为Ces基因功能的深入探索和中华稻蝗Ces基因分子靶标研发提供了依据。

高体革鯻5种同工酶的组织特异性研究

采用聚丙烯酰胺垂直梯度凝胶电泳法,分析了高体革鯻(Scortum barcoo)的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肌肉、眼睛等6种组织中的5种同工酶(乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、酯酶、过氧化物酶、过氧化氢酶)的表达情况,发现这5种酶在表型、分布和活性上均表现出明显的组织特异性,且与各组织执行的生理机能相一致。

组织特异表达启动子RSS1P在转TiERF1基因小麦中的应用

从水稻叶片中克隆了一个韧皮部组织特异表达的水稻蔗糖合酶启动子(RSS1P),将RSS1P与中间偃麦草乙烯反应因子基因TiERF1相融合构成组织特异表达的TiERF1基因表达盒,取代pAHC20中Ubi::bar基因表达盒,构建成无选择标记的韧皮部组织特异表达的pA20-RSS1P::TiERF1载体。利用基因枪将pA20-RSS1P::TiERF1与pAHC20载体混合、共轰击小麦品种扬麦12的幼胚愈伤组织,获得转RSS1P::TiERF1基因小麦。对该转基因小麦T0和T1代植株进行PCR、PCR-Southern、半定量RT-PCR和荧光定量PCR分析,证实外源RSS1P::TiERF1基因已转入受体,并且具有可遗传性;转入的RSS1P::TiERF1基因仅在根、茎、叶中表达,以根部表达量最高,在种子内不表达。纹枯病抗性鉴定和主要农艺性状考察结果表明,与受体扬麦12相比,转RSS1P::TiERF1基因小麦对纹枯病的抗性有明显提高,与转Ubi::TiERF1基因小麦的抗病性相当,而且转RSS1P::TiERF1基因小麦的农艺性状没有明显改变,说明可以利用RSS1P启动子创造更实用的转基因小麦新种质。

组织多肽特异抗原在监测乳腺癌转移中的临床应用

目的 探讨组织多肽特异抗原 (TPS)监测乳腺癌转移的临床应用价值。方法 采用ELISA法测定 4 0例健康体检者及10 8例乳腺癌患者 (其中 5 1例为治疗后转移复发 )的血清TPS、CA15 3、CEA及TPA水平 ,观察其中 2 3例转移性乳腺癌治疗前后标志物的变化。结果 术后稳定未转移者各标志物水平较术前显著下降 (P <0 .0 5 )。术后转移复发者标志物水平较术前显著升高 (P <0 .0 5 )。检出乳腺癌转移复发最敏感的指标是TPS (78.7% ) ,特异性最强的是CA15 3(96 .5 % ) ,TPS与CA15 3联合检测敏感性、特异性互补 ,有效性提高 (78.9% ) ,若再加入CEA ,可进一步提高特异性和有效性 (87.5 % )。TPS对乳腺癌骨转移最为敏感 ,远处淋巴结转移的乳腺癌患者TPS水平最高。转移性乳腺癌治疗有效 (CR +PR +SD)各标记物与治疗前相比 ,均无显著性变化 (P >0 .0 5 ) ,治疗无效 (PD) ,TPS与TPA水平均显著升高 (P <0 .0 1)。结论 TPS是检出转移性乳腺癌最为敏感的标志物 ,尤其是骨转移的患者。TPS与CA15 3、CEA联合是监测转移性乳腺癌的最佳组合。TPS水平升高表明病情进展 。

茄科植物组织特异性启动子研究进展

综述了组织特异启动子的结构、表达调控模式以及生物学功能,重点阐述茄科作物特有启动子的应用和研究进展。对下一步利用启动子改良茄科作物前景进行了展望。

人睾丸组织特异表达新基因HSD-9的克隆及其编码蛋白质功能

目的利用本室建立的人睾丸组织中不同细胞特异表达的ESTs文库克隆新基因HSD-9,初步研究HSD-9蛋白的特性及功能。方法采用电子克隆手段获得新基因HSD-9,生物信息学手段分析基因及编码蛋白质的特点,Northern blot研究HSD-9基因的表达谱,原核表达方法得到HSD-9蛋白并制备特异性多克隆抗体,免疫荧光结合激光共聚焦显微镜技术研究HSD-9蛋白在生精细胞中的定位及在哺乳动物细胞中的表达特点。结果HSD-9基因在人睾丸组织特异表达,其大鼠同源物可在大鼠各级生精细胞中表达;HSD-9-EGFP在CHO细胞和S4细胞中表达呈现沿细胞膜分布的小颗粒和偏心分布于胞内一侧的粗大颗粒;HSD-9-EGFP和网格蛋白clathrin可以部分共定位。结论HSD-9是人睾丸组织特异表达新基因,其编码蛋白质在CHO细胞和S4细胞中表达特点非常类似于内吞小体蛋白的表达特点,推测其可能参与了细胞中内吞过程的调节。

维A酸对人胎肝细胞神经组织特异基因表达的影响及其信号途径

目的:了解维A酸对人胎肝细胞神经组织特异基因表达的影响及其信号途径。方法:采用免疫磁珠法分离人胎肝CD34+细胞,培养4 d后,蛋白激酶C特异抑制剂chelerythrine chloride(3 μmol／L)处理24 h,再加入维A酸处理24 h(5×10-7mol／L),无血清培养基培养5 d,Western印迹和半定量RT-PCR法分析维A酸处理前后神经特异基因表达。结果:维A酸诱导处理使胎肝细胞表达神经组织细胞特异蛋白如Nestin、NeuN和NF-M显著增加,分别增加4.09倍、5.12倍和7.27倍(P<0.01)。而chelerythrine chloride能明显抑制维A酸诱导的神经组织细胞特异蛋白Nestin、NeuN和NF-M的表达。MAP2蛋白在维A酸处理前后均无明显表达。结论:维A酸通过蛋白激酶C途径促进人胎肝CD34+细胞表达神经组织细胞特异基因。

小鼠睾丸组织特异基因RNA干扰载体的构建及其表达的研究

目的构建并筛选小鼠睾丸组织特异基因Fank1干扰载体,为进一步研究Fank1基因功能及与Fank1基因相关男性不育的基因治疗奠定基础。方法根据Fank1基因cDNA序列,利用http://www.dharmacon.com/在线设计软件设计2条干扰序列,分别克隆至带有H1启动子的质粒载体pSuper-neo-GFP中,同时从成年B6小鼠睾丸组织扩增Fank1基因全序列,构建Fank1基因与红色荧光蛋白表达融合载体pdsRED-Fank1。采用脂质体法将2个Fank1基因干扰载体及阴性对照分别与Fank1基因表达载体共转染293T细胞,并观察siRNA对Fank1基因的抑制效应及红色荧光蛋白表达情况,分别采用RT-PCR和Western blot方法检测mRNA及蛋白质表达水平。结果经PCR检测鉴定,含干扰序列的重组质粒pSuper-sh Fank1631#,pSuper-shFank1247#及pdsRED-Fank1表达载体构建成功,测序分析完全正确。转染293T细胞36h后,荧光显微镜检查发现shFank1631、247均能明显抑制红色荧光蛋白表达,抑制效率分别为95%和90%,RT-PCR和Western blot结果表明Fank1基因在mRNA和蛋白质水平都受到显著抑制(P<0.05)。结论成功构建出小鼠睾丸特异基因干扰载体,为制备Fank1基因敲减转基因小鼠及研究Fank1基因在精子生成过程中的作用奠定了基础。

PI3K活性与BHA诱导小鼠胎肝细胞表达神经组织细胞特异基因有关

目的:了解丁羟回醚(BHA)对小鼠胎肝(FL)细胞神经组织特异基因表达的影响及其信号途径。方法:小鼠胎肝细胞,以DMEM/F12+10%胎牛血清培养液培养;第4 d后,去悬浮细胞,留黏附细胞,加入或者不加入磷酸肌醇3羟基激酶(PI3K)抑制剂LY294002(20μmol/L)处理24 h,再加入BHA至终浓度0.2 mmol/L,然后继续培养5d。用Western blot和半定量RT-PCR方法分析BHA处理前后神经组织细胞特异基因表达。结果:胎肝细胞本身表达神经组织特异基因水平较低或者不表达。BHA则促进了胎肝细胞内神经组织特异基因表达:NF-L mRNA增加5.8倍、NF-H mRNA增加8.0倍、TH mRNA增加30倍、BF-1 mRNA增加2.68倍;NF-L蛋白增加11.29倍、NF-H蛋白增加5.5倍、BF-1蛋白增加2.53倍、TH蛋白增加4.76倍。而LY294002能明显抑制BHA诱导的神经组织细胞特异蛋白NF-L、NF-H、BF-1和TH的表达。结论:PI3K活性与BHA诱导小鼠胎肝细胞表达神经组织细胞特异结构和功能基因有关。

杨树维管组织特异启动子的克隆与启动活性分析

启动子在基因表达调控中起关键性作用,它在很大程度上决定所控基因表达的时间、空间和强度。依据拟南芥ATH1芯片分析杨树维管形成时期特异表达基因的结果,选取了差异表达基因NST3,通过BLAST比对在杨树EST数据库(PopulusDB)中找到同源性较高的基因NAC068。以毛白杨为材料,在其基因组中克隆得到该基因5'侧翼区901 bp长的片段,命名为pProNAC068,将该片段置换pBI121载体中的CaMV35S启动子,并在84K杨中检测报告基因GUS的表达情况。经过GUS活性检测分析发现:该启动子可以控制外源基因在次生维管组织中特异表达,从而为基因工程中有目的的控制外源基因在维管组织中的表达奠定基础。

神经组织特异多肽治疗糖尿病周围神经病变临床疗效观察

目的 为观察神经组织特异多肽(NSE)对糖尿病周围神经病变的作用设计此实验.方法 治疗组105例糖尿病周围神经病变患者给予神经组织特异多肽针剂90μg溶于生理盐水500ml中静脉滴注,每天一次.两周一疗程,每疗程间歇4-5天,共两个疗程.结果 神经组织特异多肽能有效改善或减轻糖尿病周围神经病变所致的疼痛、麻木和其它感觉障碍,总有效率为93.33%,同对照组相比有显著差异性(P＜0.001).尽管治疗前后周围神经的传导速度有所增加,但经统计学比较两者无显著差异性.结论 神经组织特异多肽能有效地改善或减轻糖尿病周围神经由病变所引起的疼痛、麻木,缩小感觉障碍平面.间接说明微血管因素在糖尿病周围发病机制中起着较为重要的作用.

人肠组织特异抗原A33基因5′调控区的克隆及其功能分析

用基因组步行法 (genomewalker)克隆了人A33抗原基因的 5′调控区 94 0bp片段 ,并用PCR法鉴定了这一克隆的正确性 .将该序列提交GenBank ,登录号为AF2 0 0 6 2 6 .用引物延伸法 (primerex tension)确定了A33基因的转录起始位点 ,发现该位点位于一个TATA盒下游 10个碱基处 .以增强型绿色荧光蛋白为报告基因构建了不同长度的A33启动子 5′缺失载体 ,用脂质体介导的方法将这些载体转染LoVo、HeLa、2 93等细胞 ,比较了EGFP的表达水平 .研究发现 ,A33启动子上主要转录调控元件以及与组织特异性表达相关的转录调控元件位于A33启动子的 - 10 4～ + 2

普通野生稻绿色组织特异表达启动子的克隆与鉴定

绿色组织特异表达启动子可调控外源基因只在受体作物的绿色组织中定点、高效地表达。以普通野生稻为实验材料,克隆了绿色组织特异表达启动子Or GSP,构建Or GSP和GUS基因融合的表达载体,转入拟南芥中鉴定功能。启动子Or GSP长度为825 bp,含有基本的转录起始元件TATA-box和CAAT-box,以及光响应元件TCCC-motif、Sp1、G-box、I-box、GA-motif和as-2-box等。转基因拟南芥GUS组织化学染色结果表明,启动子Or GSP调控GUS基因只在绿色组织中特异表达。GUS活性测定结果显示,叶和茎中的GUS活性比根中明显提高。普通野生稻中克隆的启动子Or GSP为绿色组织特异表达启动子,可为作物分子育种提供新的调控元件。

应用组织特异性分子的保守序列鉴定人源细胞的组织来源

目的建立一种有效简便经济的检测方法,用于鉴定培养细胞的组织来源,对新鲜取材细胞归类,检测细胞组织来源。方法根据文献报道与NCBI数据库,设计17对组织特异性相关引物,分别针对16个常见的人类组织特异性因子的mRNA保守序列,培养细胞,提取mRNA,反转录为c DNA,以此为模板进行PCR,琼脂糖凝胶电泳分析;对这些引物进行特异性和敏感性的筛选;其中8对引物可用于判断人类组织特异性,以双盲实验对此方法进行验证,用于鉴定人类细胞的组织来源。结果 17对组织特异性相关引物中,特异性分子ALB、AFP、SYN、CDH16、SFTPB、LCA、FLT和MUL2的对应引物可有效应用于鉴定细胞是否源自肝、肾、神经、肺、造血、内皮和分泌组织;特异性因子PSA对应引物可广泛在人类各组织细胞中扩增出条带;鉴定其他组织的引物有待进一步研究完善优化。结论应用反转录聚合酶链式反应扩增编码组织特异性分子mRNA的保守序列可以准确鉴定待检测细胞的组织来源。本研究为鉴定常见细胞的组织来源提供新方法。

水稻组织特异性蛋白质相互作用网络构建方法

组织特异的基因表达和蛋白质相互作用是研究基因调控、蛋白质功能、细胞过程的重要部分.相较于其他模式生物在蛋白质相互作用研究方面的进展,高等模式植物水稻中组织特异性蛋白质相互作用的研究十分缺乏.因此,提出了一种用于水稻组织特异性蛋白质相互作用网络构建的计算方法.该方法主要包含三部分:第一,在统一标准下融合多数据识别组织特异的基因;第二,提出了新的同源映射方法,并集成6种模式生物相互作用数据构建和评估目标物种蛋白质相互作用网络;第三,构建不同组织的蛋白质相互作用子网,并筛选高可靠的蛋白质相互作用.为了验证方法的有效性,构建并分析了水稻首个组织特异的蛋白质相互作用网络(PTSN4R:Predicted Tissue-Specific Network for Rice). PTSN4R包含了水稻23个组织的组织特异基因及对应的组织特异蛋白质相互作用子网,为分析组织特异的基因表达和蛋白质相互作用提供了便利条件. PTSN4R有助于理解水稻的生长调控机制,为水稻增产提供线索.同时,提出的方法能够方便的应用到其他物种,促进组织特异的蛋白质相互作用网络的研究.

脂肪组织特异性表达载体的构建

采用PCR技术克隆了小鼠脂肪组织特异表达的脂肪酸结合蛋白ap2基因增强子和启动子,通过DNA重组技术将该基因增强子和启动子重组于pEGFP-N1真核表达载体上,构建pEGFP-N1-ap2重组质粒,通过PCR扩增、酶切电泳分析和测序的方法对重组质粒进行鉴定,并转染小鼠前脂肪细胞,通过荧光素酶活性检测特异性表达强度。结果表明,本实验克隆的ap2基因增强子和启动子的碱基组成与GenBank中的ap2基因序列完全一致,通过DNA重组技术将该基因增强子和启动子重组于pEGFP-N1真核表达载体上,成功构建了脂肪组织特异表达的重组质粒。为以后的转基因动物的研究奠定了基础。