生殖支原体黏附蛋白MgPa特异结合多肽的筛选与鉴定

目的：利用噬菌体展示随机12肽库筛选生殖支原体黏附蛋白（ MgPa）的特异结合多肽，以了解MgPa的生物学功能及其可能的致病机制。方法以纯化的重组生殖支原体黏附蛋白（ rMgPa）为靶分子，对噬菌体展示随机12肽库进行3轮生物淘选，收集淘选后的噬菌体进行扩增培养，利用碘化钠法提取其单链DNA进行测序分析。用ELISA、竞争性结合试验和斑点免疫印迹试验检测阳性噬菌体与rMgPa结合的特异性。结果进行3轮生物淘选后，噬菌体克隆有明显富集。随机挑取的38个噬菌体克隆中，共出现11种不同的外源性多肽序列（ P1~P11）。根据11条多肽序列中氨基酸出现的重复次数，推导出两条核心序列，即：V-H-W-D-F-R-Q-W-W-Q-P-S和D-W-S-S-W-V-H/Y-R-D-P-Q-T/S。 ELISA、竞争性结合试验和斑点免疫印迹试验的结果表明：11个代表性克隆中，有10个（P1~P10）能与rMgPa发生特异结合。结论成功筛选到了能与rMgPa发生特异结合的2条多肽，为了解MgPa的生物学功能，从而进一步了解Mg可能的致病机制提供前期实验基础。

表皮葡萄球菌附属基因调节子C特异结合多肽对聚氯乙烯材料表面细菌生物膜形成作用的体外研究

目的探讨表皮葡萄球菌附属基因调节子C(accessory gene regulator C,agr C)特异结合多肽(简称为N1)对聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)材料表面表皮葡萄球菌生物膜形成作用的体外研究。方法以表皮葡萄球菌ATCC35984(生物膜表型阳性)和ATCC12228(生物膜表型阴性)作为研究对象。首先将两菌株分别加入浓度为100、200、400、800、1 600μg/mL的N1培养,以相同浓度agrC特异结合无关肽(简称为N0)培养作为对照;24 h后测定吸光度(A)值,确定N1最佳抑菌浓度。两菌株与最佳抑菌浓度的N1及N0分别培养,6、12、18、24、30、48 h测定A值,观察N1对表皮葡萄球菌生物膜形成能力的影响;在此基础上与PVC材料片培养6、12、18、24、30 h,扫描电镜观察PVC材料表面生物膜的表面结构;另取与ATCC35984菌株培养6、12、18、24 h的PVC材料片,激光共聚焦显微镜观察生物膜厚度。结果 A值测定显示,N1对ATCC35984菌株最佳抑菌浓度为800μg/mL。ATCC12228菌株与N1及N0培养后均未形成明显生物膜;ATCC35984菌株与N1及N0培养12 h时,生物膜形成能力差异有统计学意义(P<0.05),6、18、24、30、48 h时差异无统计学意义(P>0.05)。扫描电镜观察,ATCC35984菌株与N1及N0培养后,随时间延长均见成熟生物膜结构;而ATCC12228菌株培养后均未见生物膜形成。激光共聚焦显微镜观察,ATCC35984菌株与N1培养12 h时细菌量明显少于与N0培养,且以死细菌居多;6、18、24 h时两种培养条件下细菌数量未见明显差别,均以活细菌居多;同时,N1培养12、18 h时生物膜厚度明显小于N0培养(P<0.05)。结论 N1抑制表皮葡萄球菌生物膜形成的强度有量效关系;其在聚集期阻碍细菌的增殖和聚集,抑制生物膜形成,对成熟生物膜抑制作用不明显。

噬菌体特异性结合肽对乳腺癌干细胞生物学行为的影响

目的检测GY-1(GYSASRSTIPGK)与乳腺癌干细胞的亲和性及特异性,探讨其对乳腺癌干细胞体外生物学行为的影响,评估GY-1作为乳腺癌干细胞靶向治疗载体的临床价值。方法根据前期噬菌体肽库筛选实验获得的十二肽GY-1(GYSASRSTIPGK)序列,人工合成GY-1,同时合成随机氨基酸序列十二肽GY-2(GSAYITRSGPSK)作阴性对照,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)及细胞免疫荧光法分别鉴定两者与乳腺癌干细胞231-SC(分离自MDA-MB-231细胞株)的亲和性及特异性;通过生长曲线及侵袭迁移实验检测十二肽GY-1对乳腺癌干细胞231-SC恶性生物学行为的影响。结果 ELISA结果显示,GY-1组231-SC吸光度为0.501±0.009,高于MDA-MB-231细胞(0.147±0.038)和hs578bst细胞(0.152±0.036),F=262.25,P<0.001;GY-2组中三组细胞的吸光度分别为0.148±0.003、0.146±0.005和0.149±0.001,F=0.63,P>0.05。细胞免疫荧光法显示GY-1对231-SC有高度亲和特异性,生长曲线结果显示,GY-1组231-SC细胞增殖能力显著低于GY-2组和PBS空白组,差异有统计学意义(P<0.05)。侵袭实验中GY-1组231-SC细胞透过Transwell上室的细胞数为(22±2)个,低于GY-2对照组[(41±4)个]和空白对照组[(43±6)个],F=9.03,P=0.003。迁移实验中GY-1组231-SC细胞透过Transwell上室的细胞数为(66±7)个,低于GY-2对照组[(134±11)个]和空白对照组[(141±14)个],F=14.59,P<0.001。GY-2对照组和空白组差异比较均无统计学意义(P=0.78和P=0.66)。结论十二肽GY-1对靶细胞231-SC具有高度亲和特异性,并且能够抑制231-SC的生长、侵袭迁移,有可能成为乳腺癌干细胞靶向治疗的理想载体。