竞争性等位基因特异的TaqMan聚合酶链反应法和DNA直接测序法检测KRAS G12D突变的对比分析

目的对比分析竞争性等位基因特异的TaqMan聚合酶链反应(castPCR)法和DNA直接测序法检测肠镜活组织检查标本KRAS G12D突变的差异。方法应用活组织检查钳收集肠镜下结直肠腺瘤和结直肠癌组织,抽提组织DNA,分别采用castPCR法和DNA直接测序法获得KRAS G12D的突变情况。结果腺瘤组和腺癌组castPCR法检测的KRAS G12D突变率均显著高于同组DNA直接测序法(P值均<0.05),两组间castPCR法和DNA直接测序法检测的KRAS G12D突变率的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。腺瘤组两种检测方法的突变型符合率为55.6%,野生型符合率为100.0%,阴性符合率为100.0%,总体符合率为87.5%,一致性检验Kappa值为0.643 5;腺癌组两种检测方法的突变型符合率为50.0%,野生型符合率为100.0%,阴性符合率为100.0%,总体符合率为85.0%,一致性检验Kappa值为0.583 3。提示两种方法检测阴性的一致性程度均较高,但检测阳性的一致性程度一般。Mutation Detector分析结果显示,castPCR法能够检测出突变量<1%的突变,灵敏度高达0.1%。检测突变量分析结果显示,当KRAS G12D突变量≥4%时,castPCR法和DNA直接测序法检测KRAS G12D均为阳性;当突变量<4%时,仅castPCR法能够检测出KRAS G12D为阳性。提示castPCR法能够检测出DNA直接测序法检测不出的KRAS G12D突变,较DNA直接测序法效率高。结论 castPCR法能够高效地检测肠镜活组织检查标本中低突变量的KRAS G12D,其临床实用价值较DNA直接测序法高。

等位基因特异PCR技术检测结核分支杆菌rpoB基因突变研究

目的 建立并评价等位特异多聚酶链反应检测结核分支杆菌耐利福平基因rpoB突变的方法。方法 设计与rpoB基因突变后的碱基配对的引物用于扩增突变基因,建立AS-PCR检测rpoB基因突变的方法,并对58株结核菌进行了检测。结果AS-PCR检测结核菌耐利福平相关基因rpoB的敏感性为77.3％,特异性达91.7％。AS-PCR检测rpoB基因,有1628A→T、1657C→T,G和1673C→T突变分别占耐利福平结核菌株的18.2％,22.7％和36.4％。检测rpoB突变与MIC测定RFP耐药率和PCR-SSCP检测的总符合率分别为86.2％和74.1％。检测试验可在3～4h内完成。结论 AS-PCR方法是检测结核菌耐利福平基因突变的敏感和快速方法,可在临床实验室使用并为临床医师提供治疗依据。

海南文昌汉族人群中两种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变的研究

目的:分析海南文昌人群中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因1376G→T、95A→G突变。方法:应用硝基四氮唑蓝定量法进行G6PD缺乏症的筛查,用等位基因特异PCR检测1376G→T、95A→G突变。结果:在358位海南文昌汉族人中,发现G6PD缺乏症患者20例,其中9例患者有1376G→T突变,3例患者有95A→G突变。结论:1376G→T、95A→G突变是文昌人群中常见的突变。

等位基因特异荧光PCR检测ALDH2基因多态性

目的了解人群乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因多态性的分布,评价等位基因特异荧光聚合酶链反应(PCR)检测ALDH2基因应用于临床的可行性。方法采用等位基因特异荧光PCR和DNA测序法同时检测375例患者外周血ALDH2基因型,结果不一致的标本采用基因芯片技术进行复检。结果 375例标本中,荧光PCR检出ALDH2*1/1型248例(66.1%)、ALDH2*1/2型107例(28.5%)、ALDH2*2/2型20例(5.4%),而DNA测序法则分别检出246例(65.6%)、108例(28.8%)和21例(5.6%),2种方法检测ALDH2基因型差异无统计学意义(χ~2=1.33,P=0.392),且一致性较好(κ=0.978,P<0.001)。2种方法基因型检测结果一致率为98.9%(371/375)。4例结果不一致的标本经基因芯片法复检,结果与等位基因特异荧光PCR一致。结论等位基因特异荧光PCR检测ALDH2基因型简便、可靠,能满足临床对ALDH2基因型检测的要求。

骨髓增生异常综合征中FANCF蛋白及甲基化研究

目的研究骨髓增生异常综合征(MDS)中FANCF基因甲基化状态及其蛋白表达,探讨FANCF基因甲基化及蛋白表达与MDS发病的相关性。方法以MDS患者骨髓提取的单个核细胞为研究对象,采用免疫组织化学染色法、Western blot检测FANCF蛋白表达、甲基化特异聚合酶链反应(MSP)检测FANCF基因的甲基化状态。结果 FANCF蛋白在MDS-RA组低表达,MDS-RAEB/T组更低表达,对照组正常表达;MDS组与对照组比较表达明显减低,差异有统计学意义(P<0.05)。MDS组有明显甲基化,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 FANCF蛋白在MDS组中表达下调,FA通路不能形成,可能与MDS发病有相关性。FANCF基因在MDS患者中呈现高甲基化状态,提示FANCF基因的高甲基化状态可能在MDS的疾病发生过程中起到一定的作用;MDS-RAEB/T组甲基化状态高于MDS-RA组,提示FANCF基因的甲基化可能与MDS的预后相关。

急性髓系白血病中FANCF/BRCA1蛋白表达及甲基化的检测

目的通过检测急性髓系白血病(AML)患者骨髓液单个核细胞中FANCF/BRCA1蛋白表达及基因甲基化发生率,推测其与AML发病的相关性。方法选取2006年9月—2015年6月中国医科大学附属第一医院、秦皇岛市第一医院、大庆油田总医院血液科自愿签署试验知情同意书的AML患者101例作为研究对象(AML组),其中初发亚组65例,缓解亚组36例;以同期就诊的贫血患者20例为对照组。提取患者骨髓液中的单个核细胞,采用Western印迹法半定量分析FANCF/BRCA1蛋白表达,应用甲基化特异性PCR(MSP)检测FANCF/BRCA1基因的甲基化发生率。结果与对照组比较,AMI组FANCE/BRCA1蛋白表达减低、FANCE/BRCA1基因甲基化率高,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。FANCF与BRCA1检测结果一致:蛋白的表达均与其基因甲基化状态呈负相关性(r=-0.834,P=0.006;r=-0.763,P=0.008)。而FANCF与BRCA1两基因的蛋白表达及甲基化无相关性(r=-0.051,P=0.821;r=-0.155,P=0.490)。结论 FANCF/BRCA1蛋白在AML患者中低表达,导致FA/BRCA1通路中断,与AML发病可能存在相关性。FANCE/BRCA1基因存在高度甲基化,提示两者基因高甲基化可能导致编码蛋白表达缺失,在AML的发病及进展中起到一定的作用。

一种简化的检测SMN1基因纯合性缺失的方法

目的建立一种更加准确、快捷的方法,简便地诊断纯合缺失型脊髓性肌萎缩症。方法应用双侧等位基因特异聚合酶链反应(AS-PCR)进行SMN1基因的特异扩增,并用另1个无关基因作内对照,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析,确定患儿是否为纯合缺失型脊髓性肌萎缩症。结果双重AS-PCR产物,通过PAGE或琼脂糖凝胶电泳,可准确判读患儿是否存在SMN1基因外显子7纯合性缺失。结论相对于以往常规使用的PCR-酶切或变性高效液相层析(DHPLC)方法,本研究所建立的方法不需要复杂的后续分析手段,能够更准确、快捷、简便地诊断纯合缺失型脊髓性肌萎缩症患儿。

广东省间日疟原虫环子孢子蛋白基因分型的初步研究

目的 分析广东省间日疟患者感染的间日疟原虫的基因类型和对抗疟药物 (氯喹 )的耐药性。方法 采用改良的Chelex 1 0 0离子交换法对广东省各市县的间日疟患者滤纸血标本进行处理后 ,经套式 等位 特异聚合酶链反应扩增 ,根据扩增结果判别环子孢子蛋白 (CSP)基因型。同时 ,选取部分地区的患者采用WHO体内现场试验 (7d)和扩展试验 (2 8d)法 ,进行氯喹敏感性的监测。结果 所检测的 31 2例广东省标本均为PV Ⅰ型温带族 ,未发现有PV Ⅰ型热带族和PV Ⅱ型病例 ;亦未发现广东省间日疟患者有氯喹抗药性。结论 广东省间日疟患者感染的间日疟原虫的优势种株为PV Ⅰ型温带族 。

肺癌患者血清p16基因甲基化检测意义

肺癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，肺癌的早期诊断对其治疗效果十分重要。p16基因是一种重要的抑癌基因，研究肺癌中p16基因启动子区CpG岛甲基化的发生状态具有很大的临床意义。用于检测CpG岛甲基化的特异聚合酶链反应（methylation specific PCR，MSP）方法，为DNA甲基化的研究提供了新手段。本文采用MSP技术检测肺癌患者全血中p16基因的甲基化情况，探讨其与肺癌发生发展的关系和作为肺癌早期诊断指标的可能性，现报道如下：

中国人群HLA-B等位基因与HIV-1感染者疾病进程相关性研究

目的：通过对中国人群HIV-1感染典型进展者（Typical progressors，TP）和长期不进展者（Long-term nonpmgressors，LTNP）HLA-B等位基因的分布频率的研究，探讨中国人群HLA-B等位基因与HIV-1感染者疾病进程的关系。方法：采用整群随机抽样方法从河南、吉林、辽宁、新疆、云南五省收集356例未经抗病毒治疗的HIV-1感染者血样，其中289例典型进展者和67例长期不进展者。应用聚合酶链反应-序列特异性引物技术（PCR-SSP）对其HLA-B等位基因特异性进行检测，并分析了他们的等位基因纯合子情况及Bw4／Bw6血清型，比较二组差异。结果：发现4个HLA-B等位基因位点在中国HIV-1感染人群中的表达频率较高，分别是HLA-B^＊13（TP：11．8％；LTNP：15．7％）、HLA-B^＊15（TP：17．3％；LTNP：8．2％）、HLA-B^＊40（TP：12．5％；LTNP：17．9％）、HIA-B^＊51（TP：9％；LTNP：10．4％）。其中长期不进展组HLA-B^＊67的等位基因频率为4．5％，典型进展组HLA-B^＊67的等位基因频率为1．2％，前者明显高于后者，具有显著性差异（P=0．022，OR=0．26，95％CI=0．08-0．89）。典型进展组的B^＊15的等位基因频率（17．3％）显著高于长期不进展组（8．2％）（P=0．009，OR=2．34，95％CI=1．18～4．76）。结论：HLA-B^＊67等位基因可能与延缓中国HIV-1感染者疾病进程相关，HLA-B^＊15等位基因可能与加速中国HIV-1感染者疾病进程相关。

中国北方汉族泛发型白癜风与HLA-DRB1等位基因的相关性

目的:探讨HLA-DRB1等位基因与中国北方汉族泛发型白癜风的相关性。方法:采用聚合酶链反应-序列特异引物(PCR-SSP)技术检测34例北方汉族泛发型白癜风患者的HLA-DRB1等位基因。结果:与262例正常对照组相比较,泛发型白癜风患者HLA-DRB1*0701/02、DRB1*1201/02基因频率显著增高(Pc<0.0001),HLA-DRB1*0901、DRB1*11基因频率降低(但经校正后Pc>0.05);有明确家族史的患者HLA-DRB1*1201/02基因频率显著增高(Pc<0.0001);无家族史者HLA-DRB1*0701/02基因频率显著升高(Pc<0.0001),DRB1*1201/02基因频率显著增高(经校正后Pc>0.05),DRB1*0901基因频率降低(经校正后Pc>0.05)。结论:中国北方汉族人群,HLA-DRB1*0701/02、DRB1*1201/02等位基因可能与泛发型白癜风的发病有关,而DRB1*0901、DRB1*11等位基因可能是防止其发病的“保护因子”,为进一步揭示泛发型白癜风的易感基因及免疫遗传发病机制提供线索。

福建汉族急性淋巴细胞白血病及慢性粒细胞白血病HLA-DRB1基因分析

目的探讨HLADRB1基因多态性与急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性粒细胞白血病(CML)之间的关联。方法用聚合酶链反应序列特异引物(PCRSSP)方法,对32例ALL、33例CML患者和104例健康志愿者的HLADRB1基因进行分型并分析HLADRB1基因的分布。结果与正常对照组相比,ALL患者的HLADRB106的基因频率明显增高,为15.63%,RR=3.84,χ2=8.01,P<0.001;CML患者的HLADRB109的基因频率明显增高,为24.24%,RR=3.14,χ2=7.82,P<0.01,结论HLADRB106与急性淋巴细胞白血病有关联,HLADRB109与慢性粒细胞白血病有关联。

SSP-PCR方法检测HLA-B27基因在AS早期诊断中的临床应用

目的 验证分子学方法序列特异引物聚合酶链反应（SSP-PCR）在强制性脊柱炎（AS）早期诊断中的临床应用.方法 收集陕西省人民医院2013年1月～12月疑似强直性脊柱炎患者135例,分别采用SSP PCR方法检测全血人类白细胞抗原B27位点（HLA-B27）和进行影像学骨盆、骶髂关节的X线、CT或者MRI检查,比较SSP PCR方法和影像学方法诊断的一致性及差异性.结果 疑似患者用SSP PCR方法检测HLA-B27的阳性检出率为37.0％,而影像学方法的诊断异常率为23.7％,SSP-PCR方法的阳性率较影像学方法高出13.3％.经配对X2检验,X2=9.529,P=0.003,＜0.01,两种方法阳性检出率差异具有统计学意义.结论 分子学方法检测HLA-B27基因能够用于早期预测AS的发生.

中国南方汉族人A及AB血型的基因亚型研究

目的 探讨中国南方汉族人A及AB血型的基因亚型分布，为实现跨ABO血型器官移植提供理论依据。方法取健康南方汉族成人体检者A型血330份，AB型血140份，提取DNA，采用序列特异引物聚合酶链反应（PCR—SSP）检测其基因亚型。将4种引物混合物同步扩增，根据PCR—SSP反应产生的特异性阳性条带判定相应的基因亚型。结果A型样本分型成功327份，AB型样本分型成功139份。A型血基因亚型以A／A201、A／O及A201／O较常见，占95％以上，而A201／A201及A／A不到5％；AB型血中A／B及A201／B基因亚型所占的比例较为接近，分别为54％和46％。结论中国南方汉族人A型血存在多种基因亚型，其特点明显不同于欧美白人，不同亚型之间的抗原性差异尚需要进一步研究。

兰州地区汉族寻常性、脓疱性银屑病与HLA-DRB1*0701的相关性

目的探讨兰州地区汉族寻常性、脓疱性银屑病与HLA-DRB1*0701等位基因的相关性。方法采用聚合酶链反应-序列特异引物(PCR-SSP)法检测42例寻常性银屑病、28例脓疱性银屑病和50例健康对照者HLA-DRB1*0701等位基因频率,并相互比较。结果寻常性银屑病患者组及脓疱性银屑病患者组HLA-DRB1*0701等位基因频率分别(54.8%,46.4%)与正常对照组(22.0%)比较差异均有显著性(P<0.05)。结论HLA-DRB1*0701等位基因可能是兰州地区汉族寻常性、脓疱性银屑病的遗传标志。

RhD变异型分子生物学特征及其临床意义

目的探讨RhD变异型的分子生物学特征,为临床安全输血和预防新生儿溶血病提供依据。方法采用血清学方法检测无偿献血者个体RhD抗原,鉴定RhD变异型个体血清中抗体的性质;使用聚合酶链反应序列特异引物方法检测RhD变异者RHD基因,并观察其基因变化情况。结果 RhD变异型个体的基因分型结果为D3～D6外显子缺失,表现为RHD-CE(3-6)-D,即DⅥc型。结论 RhD变异型应通过分子生物学方法准确定型,避免临床错误输血及其引发的输血反应。

包头地区寻常型银屑病与HLA-DRB1*07等位基因的相关性研究

目的探讨包头市汉族寻常型银屑病患者与HLA-DRB1*07等位基因的相关性。方法采用聚合酶链反应-序列特异引物(PCR-SSP)法,检测60例寻常型银屑病患者及80名健康对照者的等位基因频率,并相互比较。结果①HLA-DRB1*07与包头市汉族寻常型银屑病患者具有明显的相关性(P<0.01,OR=2.72)②HLA-DRB1*07在Ⅰ型、Ⅱ型寻常银屑病患者中分布无差异(χ2=0.16,P>0.05)。结论HLA-DRB1*07可能是寻常型银屑病易感基因或与易感基因相连锁。

兰州地区汉族寻常型、关节病型银屑病与HLA-DQB1*0201相关性研究

目的:分析兰州地区汉族寻常型、关节病型银屑病与HLA-DQB1*0201等位基因的相关性。方法:采用聚合酶链反应-序列特异引物(polymerase chain reaction sequence specific primers,PCR-SSP)法检测41例寻常型银屑病患者、27例关节病型银屑病患者和52名健康对照的等位基因频率。结果:寻常型银屑病患者组HLA-DQB1*0201等位基因频率较正常对照组显著增高;关节病型银屑病患者组HLA-DQB1*0201等位基因频率较正常对照组显著增高。结论:HLA-DQB1*0201等位基因可能是兰州地区汉族寻常型、关节病型银屑病的遗传标志。

包头地区寻常性银屑病与HLA-Cw* 0602等位基因的相关性研究

目的探讨包头地区汉族寻常性银屑病患者与HLACw0602等位基因的相关性。方法采用聚合酶链反应序列特异引物(PCRSSP)法,检测52例寻常性银屑病患者及60名健康对照者的等位基因频率,并相互比较。结果①HLACw0602与包头地区汉族寻常性银屑病患者具有明显的相关性(OR=3.47,P<0.01);②HLACw0602在Ⅰ型、Ⅱ型寻常性银屑病患者中分布无差异(χ2=0.006,P>0.05)。结论HLACw0602可能是寻常性银屑病易感基因或与易感基因相连锁。