基于免疫应激研究炮制对苍耳子致特异质肝损伤影响

目的探讨基于脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)介导的免疫应激模型研究苍耳子(Xanthium sibiricum Patr.)经炮制后对特异性体质肝损伤的影响并初步探索其机制。方法采用SD大鼠尾静脉注射LPS方法构建免疫应激模型,实验分为正常组(Control)、生品组(raw products,RP)、炒品组(pan-fried products,FP)、酒品组(wine products,WP)、LPS组、生品低剂量联用LPS给药组(RPL+LPS)、生品高剂量联用LPS给药组(RPH+LPS)、炒品低剂量联用LPS给药组(FPL+LPS)、炒品高剂量联用LPS给药组(FPH+LPS)、酒品低剂量联用LPS给药组(WPL+LPS)、酒品高剂量联用LPS给药组(WPH+LPS)。检测分析血清谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基转氨酶(Aspartat aminotransferase,AST)等肝功能指标、苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin staining,HE)染色和原位末端转移酶标注技术(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling,TUNEL)染色检测肝脏病理变化、血常规指标、血清细胞因子、炎症因子和氧化应激指标,对比考察苍耳子炮制前后单用或联合LPS的毒性差异。结果结果表明,苍耳子炒品、酒炙品能明显降低肝损伤大鼠血浆中ALT、AST等水平,减少大鼠肝组织炎症细胞浸润及肝细胞的凋亡,提示苍耳子炮制品具有抑制肝损伤的作用,而通过聚类图结果分析,苍耳子生品能导致特异性肝损伤;炒品苍耳子剂量低时对肝脏损伤小,剂量增加损伤加重,而酒品苍耳子对肝脏损伤较小。此外,苍耳子炒品、酒品可能通过降低炎症因子水平和降低白细胞、中性粒细胞、单核细胞的数目从而提高机体免疫状态、增强体内的抗氧化能力,恢复体内的氧化平衡,达到减轻特异质肝损伤的效果。结论机体在免疫应激的基础上,苍耳子生品能导致特异性肝损伤,经炒制、酒炙后的苍耳子减轻特异质性肝损伤,相比炒法而言,酒炙法减毒效果更为显著。

基于“三因致毒”假说的中药免疫特异质肝损伤成因机制解析

特异质药物性肝损伤(Idiosyncratic Drug-induced Liver Injury, IDILI)具有不可预测性和发病率低等特点,一直是新药撤市遇到的瓶颈问题。IDILI发生与机体、环境和药物密切相关,而机体免疫是IDILI发生的主要诱因,故免疫IDILI备受关注。囿于中草药组成和临床用药的复杂性,中药相关特异质肝损伤物质基础和机制的阐释成为研究的难点和热点。课题组前期针对何首乌肝损伤特点,提出了“三因致毒”机制假说,为中药免疫特异质肝损伤的评价和机制研究提供新的思路和方法。因此,本文基于“三因致毒”假说科学内涵,以仙灵骨葆为例,通过文献报道、临床回顾性分析及实验室研究,明确免疫应激可能是其特异质肝损伤的重要诱因;借助免疫应激模型,明确了其肝损伤的物质基础,并区分了成分类型;利用代谢组学技术初步探讨了其机制。结果表明,该假说能够解析其免疫特异质肝损伤的成因机制,具有一定的普适性,可为科学评价中药免疫特异质肝损伤风险防控提供研究思路和科学依据。

整合代谢组学和肠道菌群揭示补骨脂甲素联合淫羊藿次苷Ⅱ导致特异质肝损伤

仙灵骨葆口服制剂是我国治疗骨病的中药大品种,但近年来国家食品药品监督管理总局通报其易引起肝损伤。传统毒理学研究很难评价其肝损伤作用,我们前期发现仙灵骨葆肝损伤具有特异质属性,拆方研究发现补骨脂和淫羊藿是其导致特异质肝损伤的主要药味,且配伍后其特异质肝损伤加重,呈现七情配伍中“相反”的特点。进一步研究发现,TNF-α介导的免疫应激是其重要诱因,免疫促进成分和肝损伤易感成分存在是其另一重要诱因。然而,具体机制尚不清楚。本研究通过建立动物模型,考察了免疫促进淫羊藿次苷Ⅱ联合肝损伤易感成分补骨脂甲素对小鼠肝损伤的影响;借助非靶向代谢组学技术评价了两个成分联合对肝损伤代谢标志物的影响;利用16S r RNA测序技术探讨了肠道菌群的物种组成和相对丰度的变化。结果表明在TNF-α诱导的免疫应激小鼠模型上发现,单独给药补骨脂甲素能够引起明显肝损伤,而淫羊藿次苷Ⅱ组却无明显变化,但是淫羊藿次苷Ⅱ能够协同补骨脂甲素导致特异质肝损伤;同时代谢组学结果揭示补骨脂甲素联合淫羊藿次苷Ⅱ能够引起小鼠肝脏中甲基氨基甲酰PAF、吲哚-3-醋酸甲酯等代谢物的水平升高,而甘氨酸-酪氨酸(Gly-Tyr)、L-亮氨酰-L-甘氨酸(Leu-Gly)和L-色氨酸-L-丝氨酸(Trp-Ser)等代谢物的水平则下降。这些与肝损伤相关的差异表达代谢物主要富集在鞘脂代谢、鞘脂信号通路和坏死等代谢途径。值得注意的是,补骨脂甲素联合淫羊藿次苷Ⅱ可以诱导肝损伤小鼠肠道中的乳酸杆菌和脱硫弧菌科丰度显著增加。相关性分析结果表明,类杆菌科和脱硫弧菌科与甲基氨基甲酰基PAF和吲哚-3-醋酸甲酯呈正相关,而与Gly-Tyr、Leu-Gly和Trp-Ser呈负相关。本研究初步阐明了补骨脂配伍淫羊藿引起特异质型药物性肝损伤的物质基础和机制,为中成药临床合理使用提供了科学依据。

基于代谢组学的补骨脂致特异质肝损伤机制研究

目的从代谢组学层面探索补骨脂肝损伤机制,筛选相关生物标志物及代谢通路。方法采用尾静脉注射脂多糖(LPS)法建立特异质肝损伤模型,实验动物随机分为对照组(CMC组)、补骨脂组(BGZ组)、LPS组、BGZ+LPS组,检测血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性。通过UPLC-QTOF/MS分析不同组别大鼠血清样品的代谢轮廓谱,借助Progenesis QI(v2.4)、SIMCA v13.0等软件及MetaboAnalyst v5.0在线数据库,分析各组血清代谢标志物及其代谢通路。结果补骨脂单独给药对ALT和AST无明显影响,而联合LPS后ALT和AST显著升高,发生明显肝损伤。OPLS-DA结果显示,CMC、BGZ、LPS和BGZ+LPS组血清代谢物谱得到明显分离,筛选14个与补骨脂特异质肝损伤相关的潜在生物标志物,涉及17条代谢通路。结论补骨脂肝损伤为特异质肝损伤,其机制可能与调节鞘脂代谢、酪氨酸代谢等代谢途径相关。

免疫应激介导的朝藿定B协同补骨脂甲素导致特异质肝损伤的拟靶向代谢组学研究

补骨脂和淫羊藿是临床常用药对,既往研究显示两药可能引起特异质肝损伤,然而其物质基础以及发生机制尚不清楚。该研究基于肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)介导的免疫应激小鼠模型,以补骨脂及淫羊藿中2个主要化学成分补骨脂甲素和朝藿定B为研究对象,通过检测细胞上清液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放量和小鼠血浆中丙氨酸氨基转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基转氨酶(aspartate transaminase,AST)含量,苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察肝脏病理学变化情况,分别在细胞及动物水平评估补骨脂甲素联合朝藿定B引起肝损伤的程度。借助拟靶向代谢组学技术和多元统计分析方法,考察给药前后小鼠血浆中内源性代谢物的影响,筛选差异代谢标志物,并进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集通路分析。结果表明,在细胞水平,使用TNF-α刺激2 h后,相较于正常组及单独给药组,补骨脂甲素可以使HepG2细胞中LDH释放量显著增加;补骨脂甲素联合朝藿定B后,LDH释放量在原来基础上进一步显著增加。在动物水平,对于正常小鼠,单独或联合补骨脂甲素均不引起肝损伤;对于免疫应激模型小鼠,单独给药补骨脂甲素或者朝藿定B均可引起肝损伤,补骨脂甲素或者朝霍定B联合给药时肝损伤进一步增强,表现为小鼠血浆中ALT、AST含量显著升高,并伴随肝脏组织大量炎性免疫细胞浸润。基于拟靶向代谢组学技术,筛选得到7个共有差异代谢物,根据受试者操作特性(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析结果,其中曲线下面积(area under curve,AUC)大于0.9的包括D-氨基葡萄糖6-磷酸、N1-甲基-2-吡咯-5-甲酰胺、17β-硝基-5a-雄甾烷、葛花苷元-7-O-葡萄糖醛酸苷、N-(1-脱氧-1-果糖基)缬氨酸。因此,这5个差异代谢物可能是潜在的生物标志物。此外,烟酸盐和烟酰胺代谢及亚油酸代谢通路可能是补骨脂甲素联合朝藿定B诱导特异质肝损伤的关键代谢通路。综上,在TNF-α介导免疫应激的条件下,朝藿定B联合补骨脂甲素导致机体代谢扰动可能是二者协同导致特异质性药物性肝损伤(idiosyncratic drug-induced liver injury,IDILI)的重要机制。

基于HLA-B*35∶01的何首乌致免疫特异质肝损伤易感成分预测

目的:何首乌致肝损伤与HLA-B*35∶01等位基因密切相关,本研究借助机器学习和分子对接技术初步探索何首乌中潜在的HLA-B*35∶01易感成分。方法:通过检索文献和相关数据库,收集不良反应(ADR)与人类的主要组织相容性复合体(HLA)等位基因具有相关性的药物作为阳性数据集,未发现相关性的作为阴性数据集,利用PaDEL-Descriptor软件计算分子描述符,采用朴素贝叶斯(Na6ve Bayes)构建二分类模型。利用模型预测何首乌中与HLA相关的ADR风险成分,并结合分子对接技术进一步分析其与HLA-B*35∶01蛋白晶体的结合能力以及结合模式。结果:使用Na6ve Bayes算法构建的二分类模型平均准确率(ACC)为0.750,利用模型从何首乌41种成分中识别出了28种可能引起与HLA相关的ADR成分。分子对接结果显示何首乌中10种成分与HLA-B*35∶01均具有较好的结合能力。多肽对接结果分析,反式二苯乙烯苷、大黄素-1-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷3种成分能够使非HLA-B*35∶01呈递肽P1(LPEPLPQGQLTAY)和P2(EECDSELEIKRY)的亲和性提高,并且与P1和P2间具有优势相互作用。结论:研究基于化学描述符构建分类预测模型,并结合分子对接技术预测何首乌中潜在的3种HLA-B*35∶01易感成分,辅助何首乌特异质肝损伤(IDILI)成分研究。

一种中药相关特异质肝损伤成分筛选的体外评价方法的建立:以补骨脂和淫羊藿为例

特异质药物性肝损伤(IDILI)一直是药物研究的难点和热点。囿于中药成分的复杂,中药相关IDILI物质基础的阐明已成为目前研究的瓶颈问题。本研究以淫羊藿和补骨脂为例,通过建立体外评价模型,拟为初步筛选中药相关IDILI成分提供一种高通量的评价方法。本研究首先建立TNF-α介导的HepG2细胞易感模型,以淫羊藿和补骨脂所含指标成分为研究对象,以细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)释放量为检测指标,构建浓度−毒性响应曲线,并结合协同毒性指数确定两种中药中所含成分的协同毒性作用及强弱关系。LDH测定结果表明,补骨脂甲素、补骨脂酚、补骨脂定、补骨脂乙素、异补骨脂二氢黄酮、新补骨脂异黄酮、淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II对正常细胞和易感状态下的细胞均具有毒性作用,即这些成分既是直接肝损伤成分,又是特异质肝损伤成分;其中补骨脂甲素和新补骨脂异黄酮对正常细胞无毒性作用,但是在易感状态下有明显的细胞毒性作用,即二者为潜在特异质肝损伤易感成分。随后,本研究以补骨脂甲素为代表筛选免疫促进肝损伤成分。结果显示,淫羊藿中10种成分与补骨脂中3种成分属于直接免疫促进肝损伤成分;而特异质免疫促进肝损伤成分在淫羊藿中有10种,补骨脂中有4种;其中新补骨脂异黄酮、补骨脂定和异补骨脂二氢黄酮属于潜在的特异质免疫促进肝损伤易感成分。协同毒性指数结果显示,13种特异质免疫促进肝损伤成分(除脱水淫羊藿素外)与补骨脂甲素联用具有协同增毒作用;3种特异质免疫促进肝损伤易感成分与补骨脂甲素联用具有协同增毒作用,其中与新补骨脂异黄酮联用协同毒性指数最大,而与补骨脂定联用协同毒性指数最小。综上,该方法可成功筛选淫羊藿和补骨脂中肝损伤成分及免疫促进肝损伤成分,并可以区分肝损伤成分类型、各成分的毒性强弱程度和协同作用关系,符合IDILI的特点,以期为中药相关IDILI物质基础研究提供一种有效模型工具。

补骨脂醇提物对免疫应激模型大鼠的特异质肝损伤及机制研究

目的:基于免疫应激大鼠模型,研究补骨脂特异质肝损伤属性及相关作用机制。方法:将大鼠分为正常对照组、补骨脂3.6 g/kg组、脂多糖模型对照组、补骨脂3.6 g/kg+脂多糖模型组。药物组灌胃相应药物,造模大鼠在灌胃2 h后尾静脉注射2 mg/kg的脂多糖,在尾静脉注射脂多糖10 h时麻醉取血,取大鼠肝脏。通过生化法检测血清谷丙转氨酶(ALT)及谷草转氨酶(AST)活力,采用HE染色法检测肝脏病理变化;ELISA法检测血清白介素-1α(IL-1α)、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、表皮生长因子(EGF)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及干扰素γ(INF-γ)等多项指标含量;全自动生化分析仪检测血清免疫球蛋白G(IgG)、IgM及补体C3、C4等含量;流式细胞术检测全血免疫细胞亚群比例;免疫组化法检测肝脏中免疫细胞数量及能量代谢相关指标丝氨酸-苏氨酸激酶1(LKB1)、单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)、CREB分子调节转录共激活剂1(TORC1)蛋白表达。结果:与正常对照组比较,模型对照组可明显升高血清IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-18含量(P<0.05或P<0.01),升高全血CD4^(+)/CD3^(+)比例、CD4^(+)CD25+/CD3^(+)比例、CD4^(+)/CD8^(+)比值(P<0.05或P<0.01),升高肝脏CD3^(+)、CD8^(+)、AMPK、TORC1蛋白阳性表达(P<0.05或P<0.01);降低血清C4含量、全血淋巴细胞总数、全血CD8^(+)/CD3^(+)比例,肝脏CD4^(+)/CD8^(+)比值(P<0.01),肝脏LKB1的蛋白阳性表达(P<0.01);与脂多糖致免疫应激大鼠模型比较,补骨脂3.6 g/kg+脂多糖模型组血清ALT、AST活力明显升高(P<0.05或P<0.01),肝脏切片可见明显的病理损伤;血清IL-1α、IL-1β、IL-18和TNF-α含量明显升高,补体C4含量明显降低(P<0.05);全血CD8^(+)/CD3^(+)比例明显降低,CD4^(+)/CD8^(+)比值明显升高(P<0.05);肝脏组织中CD3^(+)、CD8^(+)、TORC1蛋白阳性表达明显升高(P<0.05)。结论:研究结果证实了补骨脂特异质肝损伤的属性,其作用机制可能与免疫应激与能量代谢相互作用有关。

基于内毒素模型的何首乌特异质肝损伤评价

基于内毒素特异质肝损伤模型,考察何首乌对大鼠肝脏的损伤作用。将何首乌(Polygonum multiflorum Thunb.)50%乙醇提取物单独灌胃或联合无毒剂量的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS,尾静脉注射2.8 mg·kg-1)给予SD大鼠,检测血清丙氨酸氨基转氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基转氨酶(AST),HE染色观察肝脏病理学改变,对比考察何首乌单用或联合LPS的量-毒关系,探讨LPS对何首乌肝损伤的影响。结果表明,单次灌胃18.9、37.8、75.6 g·kg-1的何首乌对大鼠ALT、AST无显著影响(均P>0.05),肝脏切片未见明显病理学改变;单独尾静脉注射无毒剂量的LPS,对ALT、AST无显著影响(均P>0.05),肝脏切片可见汇管区炎症细胞增多,未见肝细胞有明显病理学改变;而相同剂量的何首乌联合LPS给药后,ALT、AST显著升高(均P<0.01),肝脏切片可见中央静脉扩张、内膜脱落,中央静脉周肝细胞肿胀、坏死,汇管区有大量炎症细胞浸润,中间区部分肝细胞肿胀、坏死。进一步降低何首乌给药剂量,1.08及2.16 g·kg-1(分别相当于生何首乌6 g/日,临床剂量的2倍、4倍等效剂量)联合LPS仍然显著升高大鼠ALT、AST(均P<0.05),而0.54 g·kg-1何首乌对ALT、AST无显著影响(均P>0.05)。研究表明,对于普通正常大鼠,单次灌胃给药超大剂量(75.6 g·kg-1)何首乌无明显肝损伤作用;而在LPS特异质肝损伤模型上,临床2倍等效剂量(1.08 g·kg-1)的何首乌即可造成实验大鼠肝功能损伤,该模型可用于何首乌特异质肝损伤评价。

制首乌中顺式二苯乙烯苷转化量与特异质肝损伤的相关性研究

考察制首乌中易感物质顺式二苯乙烯苷(顺式-2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷,cis-SG)转化量与特异质肝损伤的相关性,并探讨其可能的安全限度。通过光照将制首乌50%乙醇提取液中反式二苯乙烯苷(反式-2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷,trans-SG)转化为cis-SG,得到不同转化量的样品,分别在正常大鼠和内毒素(2.8 mg·kg^(-1),iv)复制的易感性模型大鼠上给药(7.56 g·kg^(-1),ig),考察血浆生化指标、炎症因子及组织病理的改变等,比较大鼠肝损伤作用的差异。结果表明,所有制首乌样品在正常大鼠上均未引起肝损伤;在内毒素模型上,未光照、光转化cis-SG含量0.10%的制首乌样品均未见明显的肝损伤,而光转化cis-SG含量0.35%和0.70%的制首乌样品均引起明显肝脏病理改变,表现为肝细胞肿胀坏死、大量炎症细胞浸润,肝组织核转录因子-κB(NF-κB)p65表达量、细胞凋亡率均显著增加(P<0.05),同时血浆ALT、AST、TNF-α和IL-6含量均显著增加(P<0.05),过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)含量显著降低(P<0.05)。同时,临床上制首乌引起肝损伤患者的余留药物含量分析发现,其cis-SG含量(>0.40%)均高于产地收集饮片(<0.10%)。综合实验评价和临床分析结果提示,易感物质cis-SG含量与制首乌特异质肝损伤存在一定的量-毒关系;为降低临床用药风险,初步建议可将cis-SG含量0.10%作为何首乌生产炮制过程的质控限度。

免疫应激介导的壮骨关节丸致特异质肝损伤评价

利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)介导的药物特异质肝损伤模型,评价壮骨关节丸(Zhuangguguanjie wan,ZGW)诱导的肝损伤并初步探索其机制。采用SD大鼠尾静脉注射LPS(2.8 mg·kg^(-1))方法制备药物特异质肝损伤评价模型,实验分为正常对照组、LPS组、ZGW组和LPS+ZGW组。检测分析血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、肝脏病理变化(hematoxylin-eosin staining,HE染色)、肝脏组织细胞因子、全血及肝脏组织免疫细胞亚群比例。结果表明,与正常对照组相比,ZGW组和LPS组的ALT、AST、肝脏组织病理学无明显改变(P>0.05),ZGW+LPS组ALT、AST均显著升高(P<0.05),肝脏病理可见肝小叶排列紊乱,肝细胞呈单个或不规则的岛屿状或团块状坏死;肝组织细胞因子分析发现,与正常对照组相比,LPS组和ZGW+LPS组的多种细胞因子发生显著改变(P<0.05或P<0.01),但ZGW+LPS组细胞因子改变的数目和程度更高;血液及肝脏组织免疫细胞亚群分析发现,LPS组血液中CD3^+T cell/lymphocyte比例较对照组显著降低(P<0.01),而肝脏中CD3^+T细胞较对照组显著升高(P<0.05);ZGW+LPS组血液中各免疫细胞较LPS组无明显变化(P>0.05),但肝脏中CD3^+T细胞较LPS组显著升高(P<0.05),表明ZGW联合LPS增加了肝组织中CD3^+T细胞的聚集或活性。上述结果表明机体免疫活化状态下,ZGW进一步促进T淋巴细胞募集至肝脏,导致细胞因子过表达和过度炎症反应,从而诱发药物特异质肝损伤。

药物特异质肝损伤因素、机制及损伤病机探析

药物特异质肝损伤是指发生在少数易感人群中间的一种与药物药理作用及临床剂量无关且所占比例较高的特异质性药物不良反应。其中由中药所导致的特异质性肝损伤的比例有逐年增加的趋势。该文综述了近年来药物特异质肝损伤风险因素及发生机制,分析中药引起的特异质肝损伤特点及研究现状,探究中医体质与特异质肝损伤的内在联系,以期为中药特异质肝损伤预防、诊断和治疗提供借鉴。

基于统计建模的壮骨关节丸诱发特异质肝损伤相关易感性细胞因子分析

利用数据建模的方式筛选壮骨关节丸(Zhuangguguanjie wan,ZGW)特异质肝损伤相关易感细胞因子。以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)+ZGW大鼠肝脏组织中27种细胞因子水平作为数据源,以肝功能指标谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)活力值高低作为肝损伤结局的评价指标,采用Logistic回归法、分类树及随机森林法、LASSO Logistics回归法、规则发现算法与LASSO相结合的变量筛选方法,筛查ZGW特异质肝损伤相关易感细胞因子,并在THP1细胞上进行再评价。结果表明,初步筛选分析得到ZGW特异质肝损伤密切相关的易感细胞因子组合为白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素-18(interleukin-18,IL-18)和表皮细胞生长因子(epidermal growth factor,EGF),ZGW醇提物(ethanolic extract of ZGW,Et Z)联合IL-1β或IL-18协同增强THP1细胞肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)分泌,Et Z联合IL-1β协同增强THP1细胞白介素-6(interleukin-6,IL-6)的分泌,但Et Z联合EGF协同抑制THP1细胞IL-6的分泌。上述结果表明,能表征ZGW特异质肝损伤相关易感性细胞因子为IL-1β和IL-18,为临床ZGW特异质肝损伤患者的筛查提供依据,为ZGW临床安全用药及风险防控提供了新的实验证据。

基于相关可视化的壮骨关节丸特异质肝损伤与27种细胞因子的相关性分析

目的采用相关可视化的方法,探讨壮骨关节丸(Zhuangguguanjie Wan,ZGW)特异质肝损伤指标丙氨酸转氨酶(ALT)与27种细胞因子的相关性。方法 SD大鼠禁食12 h后,ig给予ZGW 3.8 g/kg,2 h后尾iv 2.8 mg/kg的脂多糖(LPS),给予LPS 10 h后水合氯醛麻醉大鼠,下腔静脉取血,采集肝组织样本。检测血清中ALT活力及肝脏组织27种细胞因子水平。R 3.2.4软件分析ALT与27种细胞因子及27种细胞因子之间的相关性。结果 ALT与巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-lα)和血管内皮生长因子(VEGF)之间具有较强的正相关性,白细胞介素-18(IL-18)、趋化因子-10(IP-10)、IL-1α和IL-1β之间具有很强的相关性,嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)或调节活化正常T细胞表达和分泌的趋化因子(RANTES)各自具有独立性。结论 ZGW特异质肝损伤与MIP-1α和VEGF之间具有较强的正相关性,为ZGW临床安全用药及风险防控提供新的实验证据。

免疫应激介导的淫羊藿苷协同补骨脂甲素致特异质肝损伤的拟靶向代谢组学研究

既往研究显示,仙灵骨葆(Xianling Gubao capsule,XLGB)肝损伤具有特异质属性,但是XLGB中免疫促进成分和肝损伤易感成分如何协同导致特异质肝损伤(idiosyncratic drug-induced liver injury,IDILI)机制尚不清楚,本研究采用拟靶向代谢组学探讨其可能机制.建立了肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)介导的体内外免疫应激模型,检测了细胞上清液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放量和小鼠血浆中天冬氨酸氨基转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)及丙氨酸氨基转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)含量,并用HE染色观察了肝脏病理学变化情况,对比考查了补骨脂甲素(bavachin,Bav)和淫羊藿苷(icariin,Ica)单用或联合TNF-α的毒性差异.采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱(ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC-QTOF/MS)技术分析不同组别小鼠血浆样品的代谢轮廓谱,结合多元统计分析方法研究了补骨脂甲素和淫羊藿苷对特异质肝损伤小鼠血浆中内源性代谢物的影响,筛选代谢标志物,并借助全基因组及代谢途径数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)进行代谢富集通路分析.细胞和动物表型实验结果初步表明,TNF-α可成功诱导HepG2细胞和小鼠免疫应激,此时补骨脂甲素和淫羊藿苷配伍给药对肝细胞和肝脏的损伤程度显著增加(P<0.01),肝脏生化和组织病理学分析也显示了类似的结果.拟靶向代谢组学结果显示,TNF-α组和对照组筛选并鉴定了26个与免疫激活相关的差异代谢物,Bav/TNF-α组和TNF-α组以及Ica/TNF-α组和TNF-α组分别筛选并鉴定了24和32个与肝损伤相关的差异代谢物,Bav/Ica/TNF-α组和Bav/TNF-α组以及Bav/Ica/TNF-α组和Ica/TNF-α组分别筛选并鉴定了12和23个与肝损伤相关的差异代谢物,Venn图和受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,Roc curve)分析得到3个由补骨脂甲素和淫羊藿苷协同影响的肝损伤代谢标志物,分别是磷脂酰乙醇胺36:5、磷脂酰乙醇胺38:6和S-硫代-L-半胱氨酸(area under the curve(AUC)>0.9).进一步将Bav/Ica/TNF-α组和Bav/TNF-α组以及Bav/Ica/TNF-α组和Ica/TNF-α组间的差异代谢物分别进行KEGG通路富集分析,共同富集的通路是甘油磷脂、花生四烯酸和亚油酸代谢.综上,在TNF-α介导免疫应激的条件下,细胞和机体内代谢网络的改变可能是淫羊藿苷协同补骨脂甲素导致IDILI的潜在机制.

基于代谢组学探讨蒲参胶囊对何首乌特异质肝损伤代谢物的影响

目的:基于代谢组学探讨在脂多糖诱导下蒲参胶囊改善何首乌特异质肝损伤的代谢物变化及作用机制。方法:将SD大鼠10只作为正常对照组,50只在脂多糖(2.80 mg/g)诱导下建立特异质模型,分别为模型对照组、蒲参胶囊5.4、10.8 g/kg组、何首乌2.7、5.4 g/kg组,各组大鼠以15 mL/kg灌胃相应药物,5 h后尾静脉注射脂多糖,8 h后收集血清及肝组织,检测血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)活力,白细胞介素1β(IL-1β)、γ干扰素(IFN-γ)含量,肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量及肝组织病理变化,用超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱法(UPLC-QE-Obritrap-MS)进行血浆代谢物及代谢通路分析。结果:与正常对照组相比,模型对照组大鼠血清ALT、AST活力均无显著变化,肝脏切片可见轻微炎症细胞浸润;与模型对照组相比,何首乌5.4 g/kg组血清ALT活力显著升高(P<0.01),IL-1β含量显著升高(P<0.01),SOD和GSH-Px活力显著降低(P<0.01),MDA含量显著升高(P<0.01),肝脏切片可见肝细胞肿胀、坏死,并伴有大量炎症细胞浸润;与何首乌5.4 g/kg组相比,蒲参胶囊10.8 g/kg组血清ALT活力显著降低(P<0.01),IL-1β含量明显降低(P<0.01),SOD和GSH-Px活力明显升高(P<0.05),MDA含量显著降低(P<0.01),肝脏切片偶见炎症细胞浸润,无其他肝组织病变;代谢组学结果显示,模型对照组、何首乌5.4 g/kg组和蒲参胶囊10.8 g/kg组鉴定出共有差异代谢物35个,包含溶血性磷脂酰胆碱、LysoPC、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、等,涉及的关键代谢通路为甘油磷脂代谢。结论:蒲参胶囊可通过调节甘油磷脂代谢改善何首乌在脂多糖诱导下引起的特异质肝损伤。

PPAR-γ依赖的何首乌免疫性特异质肝损伤机制研究

基于脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)复制的免疫性特异质肝损伤模型,考察过氧化物酶体增殖物活化受体-γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPAR-γ)对何首乌肝损伤的影响及机制。将70只SpragueDawley(SD)大鼠随机均分为对照组、LPS组(2.8 mg·kg^(-1))、何首乌组(生药2.16 g·kg^(-1))、PPAR-γ激动剂组(0.5mg·kg^(-1))、PPAR-γ激动剂+LPS组(0.5 mg·kg^(-1)、2.8 mg·kg^(-1))、何首乌+LPS组(生药2.16 g·kg^(-1)、2.8 mg·kg^(-1))及何首乌+LPS+PPAR-γ激动剂组(生药2.16 g·kg^(-1)、2.8 mg·kg^(-1)、0.5 mg·kg^(-1))。按组别分别灌胃给予PPAR-γ激动剂,每日1次,连续给药2天,第3天除对照组灌胃等量蒸馏水外,按组别分别灌胃何首乌,3 h后按组别尾静脉注射LPS,7 h后采用戊巴比妥钠将大鼠麻醉,下腔静脉取血并采集肝组织标本,检测血浆丙氨酸转氨酶(alanine transaminase,ALT)和天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST),检测血浆肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6)和干扰素-γ(interferon-γ),肝组织切片检查病理学改变和肝细胞凋亡,免疫组化染色观察肝组织切片PPAR-γ和核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)p65的表达。结果显示,肝组织PPAR-γ表达量与何首乌免疫性特异质肝损伤呈负相关,给予PPAR-γ激动剂可显著降低何首乌特异质肝损伤大鼠血浆中ALT和AST水平(均P<0.05),减轻肝组织病理损伤和肝细胞凋亡,显著促进肝组织PPAR-γ的表达并抑制NF-κB p65的表达(均P<0.05),同时显著降低血浆中TNF-α等炎症因子含量(均P<0.05)。研究结果提示,何首乌免疫性特异质肝损伤的发生与PPAR-γ通路异常抑制和相关炎症因子过表达有关,PPAR-γ激动剂可逆转何首乌特异质肝损伤,为阐释何首乌特异质肝损伤机制和寻找配伍减毒药物提供了参考依据。

中药特异质肝损伤易感因素的代谢组学研究:以何首乌制剂为例

药物特异质肝损伤的易感机制是当前临床毒理学研究的难点.本研究以何首乌制剂——润燥止痒胶囊为例,结合临床病例分析,采用代谢组学探讨其肝损伤可能的易感机制.病例分析表明润燥止痒胶囊相关肝损伤具有较典型的特异质属性,且与免疫异常活化有关.在正常小鼠上,灌胃润燥止痒胶囊对肝功能生化指标和肝组织病理无显著影响;在易感模型小鼠,免疫应激造模因素并未引起肝损伤表型,仅伴随肝组织少量炎性免疫细胞浸润,但从代谢组学可见组氨酸和丙氨酸等代谢通路显著上调(P<0.01)和色氨酸等代谢通路显著下调(P<0.01),提示代谢重编程可能是其肝损伤易感因素的重要内在机制;而在免疫应激易感因素基础上,灌胃润燥止痒胶囊引起了显著的肝损伤表型,并伴有肝组织大量炎性免疫细胞浸润和炎症反应,同时代谢组学上亦表现为花生四烯酸、亚油酸、甘油磷脂、胆汁酸等与炎症相关代谢通路的显著改变.综合提示代谢重编程可能是药物特异质肝损伤易感性的重要机制之一.基于易感因素相关的代谢紊乱通路,筛选发现了亚油酸、骨化二醇、18-羟基皮质酮等10个生物标志物可较好地识别易感模型动物(ROC分析中AUC均大于0.9),对临床识别易感人群具有潜在的应用价值.

基于免疫调控的六味五灵片对何首乌致大鼠特异质肝损伤的防治作用

目的基于内毒素脂多糖(LPS)模型,探讨六味五灵片对何首乌致大鼠特异质肝损伤的防治作用。方法将80只SD大鼠随机分为对照组,LPS(2.8 mgNg)组,单独何首乌(生药2.16 gNg)组,LPS(2.8 mg/kg)+何首乌(生药2.16 g/kg)组,LPS(2.8 mg/kg)+何首乌(生药2.16 gNg)+六味五灵片低、中、高剂量(0.4、0.8、1.6 g/kg)组及LPS(2.8 mg/kg)+何首乌(生药2.16g/kg)+阳性药联苯双酯(2mg/kg)组。按组别分别ig给予相应剂量的六味五灵片和联苯双酯,每日1次,连续给药2d,第3天除对照组和LPS组ig等量蒸馏水外,按组别分别ig给予何首乌醇提物,3 h后按组别尾ivLPS,给予LPS7 h后戊巴比妥钠麻醉大鼠,下腔静脉取血并采集肝组织标本。比色法检测血浆中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST),HE染色观察肝组织病理学变化,TUNEL检测分析肝细胞凋亡,ELISA法检测血浆中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、γ干扰素(IFN-γ)水平,免疫组化染色观察肝组织核转录因子-κB(NF-κB)p65的表达。结果六味五灵片能明显降低何首乌诱导的特异质肝损伤大鼠血浆中ALT和AST水平(P<0.05),减轻肝组织病理损伤和肝细胞凋亡,明显抑制NF-κB p65的表达(P<0.05),同时明显降低血浆中TNF-α等炎症因子水平(P<0.05、0.01)。结论六味五灵片可通过抑制NF-κB信号通路,减轻炎症反应,防治何首乌诱发的特异质肝损伤。

基于免疫应激的白鲜皮致特异质肝损伤评价研究

利用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)介导的药物特异质肝损伤模型,评价白鲜皮水提物(Cortex Dictamni aqueous extract, AE)和醇提物(Cortex Dictamni ethanol extracts, EE)致大鼠肝损伤的作用。首先采用大鼠急性毒性实验评价了AE和EE致肝损伤作用,进一步采用SD雄性大鼠构建LPS (2.8 mg·kg^(-1))模型(伦理审批号:IACUC-2018-008),通过血清谷丙转氨酶(alanine transaminase, ALT)、天冬氨酸氨基转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)等肝功能指标检测,肝脏病理变化(hematoxylin-eosin staining, HE染色)、肝组织TUNEL染色、血清细胞因子检测及网络药理学等方法分析AE和EE致肝损伤作用。结果显示,各剂量组AE和EE对大鼠主要肝功能指标ALT、AST均无显著影响(P>0.05),肝脏病理和血清细胞因子等指标也未见明显改变。而在LPS模型中, 4.2 g·kg^(-1)AE和EE均可使ALT、AST显著升高(P<0.01),其中AE作用显著高于EE,肝脏病理显示两组肝细胞呈不同程度损伤, TUNEL染色则可见大量凋亡细胞,血清细胞因子检测则发现AE可显著促进肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)和白细胞介素-6 (interleukin-6, IL-6)的表达(P<0.01)。上述结果表明,在免疫应激状态下,白鲜皮可导致特异质肝损伤, AE所致肝损伤程度较EE更重。本研究为白鲜皮及其制剂肝损伤的机制研究和临床肝损伤风险防控提供依据。