特氏杜氏藻中乙酰辅酶A合成酶的基因克隆、表达、纯化及活性测定

乙酰辅酶A合成酶(ACS)催化合成乙酰辅酶A,它是油脂代谢和醋酸盐代谢的重要节点之一。本研究利用反转录PCR(RT-PCR)技术和cDNA末端快速扩增(RACE)技术分离得到了特氏杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)乙酰辅酶A合成酶(Dt ACS)的c DNA全长(2464 bp),预测其开放阅读框(ORF)为2184 bp,727个氨基酸由此段编码。序列比对显示Dt ACS与绿藻ACS最为相似(与衣藻Chlamydomonas reinhardtii有68%一致;与团藻Volvox carteri f.nagariensis有70%一致)。选用带有硫氧还蛋白标签(Trx-tag)的pET32a(+)作为原核表达载体,并将Dt ACS转入pET32a(+)中从而构建了pET-32a-Dt ACS质粒。将其转入BL21(DE3)感受态细胞中,同时将pET-32a空载体也转入BL21(DE3)感受态细胞中,分别得到重组菌pET-32a-Dt ACS-BL21(DE3)和对照菌种pET-32a-BL21(DE3)。将重组菌在18℃、终浓度为0.6 mmol/L的IPTG条件下诱导12 h,表达出来的带有Trx-His标签融合蛋白的Dt ACS约为8.74 ku(6.99ku+1.75 ku)。此外,将表达得到的重组蛋白经Ni2+亲和层析柱纯化,纯化后蛋白比活力为52.87 U/mg。