小麦牻牛儿牻牛儿基脱氢酶基因的克隆及电子定位与表达分析

为更好地了解小麦维生素E的生物合成并将其应用于营养品质改良,以电子和实验克隆相结合的方法克隆分离了小麦牻牛儿牻牛儿基脱氢酶(GGH)基因的cDNA序列,序列号为DQ139268。序列分析结果表明,该cDNA序列含有一个完整的开放读码框,编码462个氨基酸,含有保守的ChlP结构域,氮端有信号肽序列,定位于叶绿体中。氨基酸序列比对和系统发育分析结果显示,不同物种之间GGH基因编码的氨基酸序列同源性都较高。用生物信息学工具将该基因定位于小麦第六部分同源群的长臂上。RT-PCR和电子组织表达分析结果显示该基因在光合器官中表达量丰富,这可能与其亚细胞定位有关。

日本百脉根■牛儿基■牛儿基氢化酶的电子克隆及进化分析

根据物种间同源基因相对保守的特点,利用生物信息学的方法,以拟南芥牛儿基牛儿基氢化酶(GGH)基因cDNA序列为信息探针,搜索GenBank中的HTGs数据库,找到一个与之高度匹配的日本百脉根基因组DNA序列LJT46M09,用GENSCAN软件分析该序列得到一个包含2个外显子和1个内含子的基因。以此基因序列BLAST检索GenBank中的est-others数据库获得了同源的EST片段。进行EST拼接后得到该基因的cDNA序列,GenBank登录号为DQ013361,由1 389 bp核苷酸组成,具有完整的开放阅读框架(ORF),推测编码蛋白为462个氨基酸。推导的氨基酸序列与大豆、截形苜蓿、烟草、拟南芥、小麦、水稻的牛儿基牛儿基氢化酶基因氨基酸序列的一致率分别为91%、89%、84%、81%7、3%、74%。该基因与叶绿素等的生物合成有关。

活性污泥的基质代谢脱氢酶活性测定

阐述了活性污泥在曝气反应中的基质代谢脱氢酶活性 (Ds)和内源呼吸脱氢酶活性(De)的变化规律及其关系 ,提出了通过分别测定总脱氢酶活性 (Dt)和De 来间接测定Ds 的方法。测定结果表明 ,这 3种脱氢酶活性均随曝气反应的进行而不断变化 ,性能较好的活性污泥的Dt 与Ds 相近 ,而且通过适当投加基质可以明显提高Dt。

纸基微孔阵列芯片比色法检测乳酸脱氢酶

利用纸基微芯片便捷、直观的优势,采用吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）/氯化硝基四氮唑蓝（NBT）显色体系,借助凝胶成像仪和普通照相机两种成像方式,建立了纸基微孔阵列芯片比色法检测乳酸脱氢酶（LDH）的方法。在最佳实验条件下,显色强度与LDH浓度呈线性相关。采用凝胶成像仪检测时,线性范围为10~150 U/L,检出限（3σ）为9.44 U/L（n=18）。采用照相法获得的线性范围为15~150 U/L,检出限（3σ）为12.36 U/L（n=18）。实验表明,人血清白蛋白（HSA）对显色结果具有增强作用,探讨了HSA的增色作用,并以HSA为增强试剂得到工作曲线。基于纸基微孔阵列芯片的LDH活性测定方法具有操作简单、结果直观可见、灵敏度高等优点,对于脱氢酶类的便捷检测有一定参考价值,可望在生物医疗检测领域获得应用。

芪丹通脉片对大鼠脑缺血再灌注损伤乳酸脱氢酶及氧自由基的影响

目的 :观察芪丹通脉片 (QDTMT)对大鼠脑缺血再灌注损伤的防护作用并探讨其机制 .方法 :选用SD大鼠 70只 ,随机分为 7组 (n =10 ) ,即假手术组、模型组、芪丹通脉片低剂量组、中剂量组和高剂量组、华佗再造丸组及尼莫地平组 ,各组均用生理盐水配制等体积药液灌胃 7d ,每日 1次 .造成大鼠脑缺血再灌注模型 ,观察各组大鼠乳酸脱氢酶(LDH)和超氧化物歧化酶 (SOD)活性及丙二醛 (MDA)含量的变化 .结果 :与假手术组比较 ,模型组大鼠LDH活性、MDA含量显著升高 ,SOD活性显著下降 ,有显著性差异 (P <0 .0 1) .与模型组比较芪丹通脉片各剂量组、华佗再造丸组及尼莫地平组LDH活性、MDA含量明显下降 ,SOD活力明显上升均有显著性差异 (P <0 .0 1) .结论 :芪丹通脉片对大鼠脑缺血再灌注损伤有显著的防护作用其机制可能与抗自由基损伤有关 .

发根农杆菌介导丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶1基因RNA干扰载体的转化

目的:利用发根农杆菌ACCC10060介导丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶1基因(SmGGPS1)RNA干扰(RNAi)载体转化丹参叶片,生成SmGGPS1的RNAi转基因毛状根。方法:根据已克隆到的SmGGPS1特异区域设计并合成2段RNAi序列,分别插入RNAi双元载体pK7GWIWG2D(Ⅱ)中,构建2个含卡那霉素(Kan)和绿色荧光蛋白(GFP)双筛选标记的植物表达载体pK7GWIWG2D(Ⅱ)-SmGGPS1-RNAi2和pK7GWIWG2D(Ⅱ)-SmGGPS1-RNAi3;利用带有上述2个RNAi载体的发根农杆菌ACCC10060侵染丹参叶片,诱导生成转基因毛状根;通过Kan抗性筛选和GFP绿色荧光观察统计转化率。结果:分别得到SmGGPS1-RNAi2和SmGGPS1-RNAi3转基因毛状根301根和399根,平均转化率为60.34%。结论:首次建立了发根农杆菌介导的外源基因转化丹参的体系。

短链酰基辅酶A脱氢酶在心肌细胞凋亡中的作用

目的:研究短链酰基辅酶A脱氢酶(short-chain acyl-Co A dehydrogenase,SCAD)在心肌细胞凋亡中的变化,探讨其与心肌细胞凋亡之间的关系。方法:以叔丁基过氧化氢(tert-butyl hydroperoxide,t BHP)刺激心肌细胞建立凋亡模型。检测细胞存活率、SCAD mRNA和蛋白表达、SCAD活性以及游离脂肪酸含量变化;并采用SCAD的最优干扰序列siRNA-1186进行干扰,观察其对心肌细胞凋亡的影响。结果:与对照组相比,在t BHP诱导的心肌细胞凋亡模型中,SCAD的mRNA和蛋白表达均显著下调。与阴性对照序列组相比,siRNA-1186干扰后心肌细胞的SCAD表达和活性明显下降,心肌细胞游离脂肪酸含量明显增加,同时,心肌细胞出现了明显凋亡,与t BHP诱导的心肌细胞凋亡趋势一致。结论:SCAD表达失调可能参与心肌细胞凋亡的过程,上调SCAD可能成为干预心肌细胞凋亡的重要环节之一。

芪丹通脉片对大鼠心肌缺血/再灌注乳酸脱氢酶及氧自由基的影响

目的探讨芪丹通脉片对大鼠心肌缺血/再灌注损伤(RMMI)的防治及其作用机制。方法选用SD大鼠36只,随机分为6组(n=6),即假手术组、模型组、芪丹通脉片低剂量组、中剂量组和高剂量组、恬尔心组,用生理盐水配制等体积药液灌胃14 d,1次/d。造成大鼠心肌缺血/再灌注模型,检测各组大鼠乳酸脱氢酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量。结果与假手术组比较,模型组大鼠LDH活性、MDA含量显著升高,SOD活性显著下降(P<0.05)。与模型组比较芪丹通脉片各剂量组、恬尔心组LDH活性、MDA含量显著下降,SOD活力显著上升(P<0.05)。结论芪丹通脉片对大鼠RMMI有显著的保护作用,可能与其有效地消除或抑制氧自由基的损伤有关。

醇醛脱氢酶的分离纯化及其基因文库的构建和筛选

在维生素C的发酵生产过程中,普通生酮基古龙酸菌S2(Ketogulonigenium vulgare)能产生醇醛脱氢酶,将L-山梨糖转化为VC的前体2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)。通过超声波破碎菌体、硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析,QSepharose High Performance柱层析等过程,从普通生酮基古龙酸菌S2发酵液中分离纯化了醇醛脱氢酶,并用该纯化酶免疫新西兰兔制备出了合格抗血清。同时,普通生酮基古龙酸菌S2基因组DNA经Sau3AⅠ部分酶切后,与黏粒载体pKC505连接,用包装蛋白进行包装,转染大肠杆菌DH5浕,构建了基因组文库。最后应用免疫酶斑点技术(Dot-ELISA)从12000个克隆子中筛选得到一个阳性克隆K719#。通过检测该基因工程菌的活性,表明K719#具有使L-山梨糖转化为2-KLG的功能,从而使醇醛脱氢酶在大肠杆菌中获得了高效表达,这为简化VC的生产工艺奠定了基础。

纤维二糖脱氢酶生成羟自由基和还原各种自由基的研究

利用电子顺磁共振（ＥＳＲ）技术和硫代巴比妥酸（ＴＢＡ）反应研究了纤维二糖脱氢酶（ＣＤＨ）生成·ＯＨ和还原各种自由基的能力．以纤维二糖为电子供体时，ＣＤＨ可以生成·ＯＨ．·ＯＨ生成量与ＣＤＨ、Ｆｅ３＋和Ｏ２的浓度有关．加入过氧化氢酶可使·ＯＨ的生成明显减少．ＣＤＨ可以还原自旋加合物［ＰＢＮ－ＯＨ］·、氮氧自由基和天然木素分子中的自由基．结果表明，ＣＤＨ具有生成·ＯＨ和还原各种自由基的能力．

篦子三尖杉牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因的克隆与序列分析

三尖杉是我国特有植物,主要含有生物碱、黄酮及萜类等生物活性物质。以篦子三尖杉为试验材料,根据同源克隆的方法扩增三尖杉牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(GGPPS)基因,并通过生物信息的方法对该基因进行鉴定和分析。结果表明,篦子三尖杉GGPPS基因全长1 217 bp,含有1个完整的1 182 bp开放阅读框(ORF),编码393个氨基酸的蛋白序列,GGPPS蛋白相对分子量为43.042 ku,理论等电点(p I)为6.57,其二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成;蛋白质同源分析表明,三尖杉GGPPS含有多聚异戊二烯基合成酶家族中保守的5个特征性结构和2个富含天冬氨酸的区域;同源模建分析显示,三尖杉GGPPS具有GGPPS蛋白典型的三维结构,特别与薄荷GGPPS蛋白的三维结构及活性位点极其相似;系统进化分析表明,三尖杉GGPPS蛋白归属植物进化支,且与加拿大红豆杉、曼地亚红豆杉、海南粗榧的GGPPS蛋白归为同一分支。

从小菌基因组文库中筛选醇醛脱氢酶阳性克隆

采用免疫学方法对已构建的普通生酮基古龙酸菌(俗称小菌)的基因组文库进行筛选。应用Dot-ELISA方法及功能检测,成功地从菌基因组文库中筛选出具醇醛脱氢酶活性的阳性克隆。

■牛儿基■牛儿醇转移酶抑制对大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响

目的研究1种牛儿基牛儿醇转移酶抑制(GGTI-286)对大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响。方法用含有不同浓度的GGTI-286处理被10%胎牛血清(FCS)或血小板源生长因子(PDGF)刺激的大鼠肾小球系膜细胞,应用细胞增殖ELISA系统测定溴化脱氧尿嘧啶核苷进入细胞的量来评估DNA的合成,并测定细胞的数量。用蛋白质印迹法研究GGTI-286对原癌基因(Ras)蛋白和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)活化的影响。结果GGTI-286对10%FCS或PDGF刺激大鼠肾小球系膜细胞DNA的合成抑制是剂量依赖性,并且能够抑制细胞的生长,应用台盼蓝排除试验,GGTI-286并不改变系膜细胞的存活率。GGTI-286也能够抑制10%FCS或PDGF诱发的肾小球系膜细胞Ras蛋白活动和MAPK的激活。结论GGTI-286通过影响肾小球系膜细胞Ras蛋白活动和MAPK的激活而抑制肾小球系膜细胞增殖,这可能为治疗系膜增殖性肾小球疾病提供1种新的方法。

3-磷酸甘油醛脱氢酶的修饰蛋白减轻急性肾小管坏死自由基损伤的研究

目的通过分离、纯化、鉴定及蛋白质氨基酸测序3-磷酸甘油醛脱氢酶(G3PD)修饰蛋白(MP),观察庆大霉素诱发大鼠急性肾小管坏死(ATN)时,MP抗自由基损伤及对肾小管上皮细胞的修复作用。方法采用Western印迹法及间接免疫荧光检测等方法对MP进行鉴定分析。纯化的MP以氨基酸自动分析仪测定氨基酸序列。将SD雄性大鼠随机分成正常对照组(腹膜内注射0.9%氯化钠溶液2 mL/d×7 d+0.9%氯化钠溶液2 mL/d×14 d)、阴性对照组(腹膜内注射庆大霉素140 mg·kg^(-1)·d^(-1)×7 d+0.9%氯化钠溶液2 mL/d×14 d)、阳性对照组(腹膜内注射庆大霉素140 mg·kg^(-1)·d^(-1)×7 d+表皮生长因子20μg·kg^(-1)·d^(-1)×14 d)及实验组(腹膜内注射庆大霉素140 mg·kg^(-1)·d^(-1)×7 d+MP 250μg·kg^(-1)·d^(-1)×14 d)。应用MP观察7和14 d的ATN大鼠模型血清及肾组织中脂质过氧化物(LPO)、还原型谷光苷肽(GSH)及一氧化氮(NO)水平的动态变化。通过光学显微镜、电子显微镜及免疫组织化学等形态学方法,观察MP修复ATN时大鼠肾小管上皮细胞的组织形态学及细胞间黏附因子-1(ICAM-1)表达的变化。同时测定血肌酐(SCr)水平。结果间接免疫荧光法证实,MP位于细胞质内,且钾浓度为3.2 mmol/L条件下的荧光强度明显强于钾浓度为5.4 mmol/L时。MP由25个氨基酸残基组成。实验组的血清及肾皮质匀浆中LPO、NO水平均较阴性对照组明显下降(P值均<0.01),GSH明显上升(P值均<0.01)。MP组肾脏病理改变比模型组明显减轻,同时SCr下降(P<0.01);实验组的ICAM-1表达较阴性对照组下调。结论自由基积极参与ATN肾小管上皮细胞损伤,MP能够抑制ATN大鼠血清及肾组织中LPO、NO水平的升高及GSH水平的下降。MP具有抗自由基损伤及修复肾小管上皮细胞的作用。

乙醛脱氢酶1与基质细胞衍生因子-1在胃癌患者组织中的表达及临床意义

目的:探究胃癌患者肿瘤组织中乙醛脱氢酶1(Aldehyde dehydrogenase 1,ALDH1)和基质细胞衍生因子-1(Stromal cell derived factor-1,SDF-1)的表达情况以及临床意义。方法:收集312例于2012年6月~2014年6月在汉川市人民医院进行根治性切除胃癌的患者病理组织及癌旁组织标本且资料齐全的患者进行分析。结果:ALDH1在胃癌组织中的表达与胃癌患者的TNM分期及有无淋巴结转移有关系(P<0.05),SDF-1在胃癌组织中的表达与胃癌患者的TNM分期,有无淋巴结转移及浸润深度有关系(P<0.05),结论:胃癌患者组织中ALDH1和SDF-1表达显著升高,与胃癌患者分期及淋巴结转移密切相关,联合检测两个指标可以为预测胃癌的转移及预后提供理论依据。

山梨糖脱氢酶基因在酮古龙酸菌中的过表达

目的在酮古龙酸菌中克隆并过表达山梨糖脱氢酶基因,以便提高单菌发酵产2-酮基-L-古龙酸的能力。方法从酮古龙酸菌DSM4025基因组中克隆获得山梨糖脱氢酶基因(sorbose dehydrogenase,sdh),酶切连接到含有双亲本接合转移关键基因即可移动基因(mobilization,mob)的p BBR1MCS-2质粒上,构建p BBR1MCS-2-sdh重组质粒;再将p BBR1MCS-2、p BBR1MCS-2-sdh分别转入供体菌大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)S17-1中,以酮古龙酸菌(Ketogulonigenium sp.)Rif-B-003为受体菌进行双亲本接合转移。挑取利福霉素(Rifamycin,Rif)和卡那霉素双抗平板上的接合子进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、双酶切和测序验证。取重组菌进行摇瓶发酵,用菌体蛋白的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)电泳结果来验证阳性克隆的过表达成功,并检测发酵终点2-酮基-L-古龙酸的产量。结果构建的重组质粒p BBR1MCS-2-sdh成功转入酮古龙酸菌(Ketogulonigenium sp.)Rif-B-003中,SDS-PAGE检测到,发酵终点菌体蛋白在58 ku(目标蛋白)处条带有加深,重组菌株发酵终点2-酮基-L-古龙酸产量相比于对照菌株酮古龙酸菌(Ketogulonigenium sp.)Rif-B-003提高了20.86%。结论山梨糖脱氢酶基因在酮古龙酸菌Rif-B-003里过表达成功,可以提高发酵终点2-酮基-L-古龙酸的产量。

SBR法处理还原段DSD酸废水脱氢酶活性的研究

对SBR法处理还原段DSD酸生产废水处理中污泥活性进行了分析。脱氢酶活性能及时准确地反映污泥活性变化,预知水质波动。在整个代谢过程中,总脱氢酶活性(Dt)和基质脱氢酶活性(Ds)变化规律相似;当了解体系大体情况时,Dt可代替Ds反映污泥活性变化。Dt与可降解COD浓度之间较好的服从莫诺关系式,Dt具有生化反应速率的意义。研究表明,在温度为30℃,葡萄糖投加量为250mg/L,有机负荷为0.6kg(/kg·d),pH值为7的条件下,脱氢酶活性最高。

联合检测血清乙醛脱氢酶1(ALDH1)和基质金属蛋白酶对子宫内膜异位症的诊断价值分析

目的探讨子宫内膜异位症(EM)诊断中应用血清乙醛脱氢酶1(ALDH1)与基质金属蛋白酶(MMP)联合诊断的价值。方法选择2017年3月—2019年3月镇平县中医院收治的经疑似EM的患者100例进行研究,均测定血清ALDH1与MMP-9,根据血清ALDH1≥2.0 pg/mL为阳性、MMP-9≥60μg/L为阳性,与病理结果对照,计算单一测定血清ALDH1与MMP-9诊断及二者联合诊断的敏感度、特异度、准确度,并比较分析。结果病理证实有90例EM,随着EM患者分级增加,血清ALDH1与MMP-9水平随之升高,不同分级对比差异有统计学意义(P<0.05);单一测定血清ALDH1诊断敏感度、特异度、准确度依次为45.56%、20.00%、43.00%,单一测定血清MMP-9诊断的敏感度、特异度、准确度依次为42.22%、10.00%、39.00%,而二者联合检测诊断的敏感度、特异度、准确度依次为85.56%、50.00%、82.00%,统计学分析显示二者联合检测诊断敏感度、特异度、准确度明显高于单一检测诊断(P<0.05)。结论EM患者血清ALDH1与MMP-9水平有明显升高趋势,随着病情加重,血清ALDH1与MMP-9升高更显著,可见和EM发生、发展有关,同时联合二者检测诊断相比单一诊断价值更高,值得应用。

吩嗪甲酸硫酯对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏的人红细胞某些生化指标的影响

为探讨葡萄糖 6 磷酸脱氢酶 (G6PD)缺乏的人红细胞在自由基作用下的变化情况 ,通过测定自由基作用前后G6PD缺乏人红细胞变形能力、高铁血红蛋白生成、过氧化氢酶活力、还原型谷胱甘肽 (GSH)、还原型三磷酸吡啶核苷 (NADPH)的浓度 ,并与正常红细胞比较。结果显示G6PD缺乏红细胞在氧自由基作用下变形能力、过氧化氢酶活力、GSH及NADPH水平与正常红细胞相比显著下降 (P <0 0 1) ,而高铁血红蛋白生成显著增加 (P <0 0 1) ,从而得出G6PD缺乏红细胞氧化易感性增强导致细胞损伤。

古汉养生精对运动小鼠血乳酸、乳酸脱氢酶和运动时间的影响

目的:观察以补肾益脾为治则的古汉养生精对力竭运动小鼠血乳酸、乳酸脱氢酶和运动时间的影响,以及对抗运动性疲劳的作用。方法:实验于2004-04/05在湛江师范学院中心实验室和体育系实验室完成。①4周龄昆明种健康小鼠30只,雌雄各半,体质量(32.80±2.42)g,按完全随机数字方法分为对照组,运动组,古汉养生精组,每组10只。古汉养生精片(购自清华紫光古汉生物制药有限公司,国药准字Z10970128,由淫羊藿、黄精、黄芪、枸杞等组成,含生药2g/片),蒸馏水溶解稀释成10%溶液。②运动组和古汉养生精组每天进行游泳1次,6d/周,共4周,第1周每天游泳1h,第2周每天游泳1.5h,第3,4周每天游泳2h。③古汉养生精组每天按3g/kg体质量的古汉养生精灌胃,运动组以等体积生理盐水灌胃,对照组不作任何处理。④4周后记录小鼠游泳力竭时间和血乳酸含量、血浆乳酸脱氢酶活性、超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量。结果:①小鼠游泳力竭时间:运动组小鼠游泳力竭时间显著短于古汉养生精组眼(347.69±61.66),(438.68±62.86)min,P<0.01演。②血乳酸含量、乳酸脱氢酶活性、丙二醛含量:运动组显著高于古汉养生精组(926.81±84.20)比(659.45±73.35)mmol/L,P<0.01;(194.215±5.727)比(162.179±7.400)μkat/L,P<0.05;(15.46±0.46)比(9.04±0.93)μmol/L,P<0.01演。③血浆超氧化物歧化酶活性:运动组显著低于古汉养生精组眼(1.480±0.268),(2.276±0.273)μkat/L,P<0.01演。结论:服用古汉养生精可以延长小鼠力竭运动时间,减轻运动性疲劳的产生和自由基介导的脂质过氧化反应。