犀角地黄汤合方对脂多糖诱导的人树突状细胞功能的影响

目的:观察犀角地黄汤合方含药血清(XJDH)对体外诱导的树突状细胞(DC)相关功能的影响,探讨犀角地黄汤合方治疗ITP的作用机制。方法:采集6名健康志愿者外周血样本,利用密度梯度离心法分离出单个核细胞,利用磁珠分选出CD14+单核细胞,用重组人粒细胞⁃巨噬细胞集落刺激因子(GM⁃CSF)及重组人白介素4(IL⁃4)诱导成DC。将DC分为3组:对照组、模型组和XJDH组。通过CCK⁃8法确定含药血清干预浓度及时间,模型组和XJDH组分别加入终浓度为1μg/mL的脂多糖(LPS)刺激24 h后诱导DC成熟,对照组、模型组加入正常大鼠血清,XJDH组加入犀角地黄汤合方含药血清均干预24 h。利用流式细胞术(FCM)检测DC表面分子CD80,CD83,HLA⁃DR的水平,利用蛋白印迹法(WB)检测细胞TLR4和NF⁃κB表达情况,用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测细胞上清液中IL⁃6,IL⁃12,TNF⁃α的水平。结果:与对照组相比,LPS刺激能够使DC表面分子CD80、CD83、HLA⁃DR表达增加,TLR4和NF⁃κB表达随之上升,分泌的相关促炎因子IL⁃6、IL⁃12、TNF⁃α增加(P<0.05)。相比于模型组,经XJDH干预后DC表面分子CD80、CD83、HLA⁃DR表达减少(P<0.05),TLR4、NF⁃κB蛋白表达下降(P<0.05),DC细胞上清液中IL⁃6、IL⁃12、TNF⁃α水平明显降低(P<0.05)。结论:犀角地黄汤合方含药血清可下调TLR4/NF⁃κB信号通路相关蛋白表达,抑制DC成熟,减少促炎因子的分泌,这可能是犀角地黄汤合方治疗免疫性血小板减少症的机制之一。

犀角地黄汤合方对DC激活ITP患者T细胞增殖分化的影响

目的 观察犀角地黄汤合方含药血清对树突状细胞(DC)激活T细胞增殖分化的影响及其对免疫性血小板减少症(ITP)的作用机制。方法 将10只雄性SD大鼠随机分为含药血清组和空白血清组,每组5只,分别使用犀角地黄汤合方和蒸馏水连续灌胃3 d,腹主动脉取血制备含药血清和空白血清。分选15例健康志愿者及8例ITP患者CD4^(+)T细胞,将荷载血小板抗原的DC与CD4^(+)T细胞共培养,采用随机数字表法分为对照组,模型组,犀角地黄汤合方低、中、高剂量组。对照组为荷载血小板抗原的DC与健康志愿者CD4^(+)T细胞,模型组和犀角地黄汤合方低、中、高剂量组为荷载血小板抗原的DC与ITP患者的CD4^(+)T细胞,其中对照组和模型组加入大鼠空白血清,犀角地黄汤合方低、中、高剂量组分别加入体积分数为5%、10%及20%大鼠含药血清。流式细胞术(FCM)检测CD4^(+)T细胞的增殖情况,各组调节性T细胞(Treg)和效应性T细胞(Teff)的比例以及CD4^(+)T表面程序性死亡受体-1(PD-1)的表达量;酶联免疫吸附试验检测各组细胞上清液中促炎因子白细胞介素(IL)-2、干扰素-γ(IFN-γ)、IL-17以及抑炎因子转化因子-β(TGF-β)、IL-10的表达量。结果 与对照组比较,模型组CD4^(+)T细胞增殖百分比、Teff细胞比例以及促炎因子IL-2、IFN-γ和IL-17升高(P<0.05),Treg细胞比例、CD4^(+)T细胞表面PD-1表达量以及抑炎因子TGF-β、IL-10水平降低(P<0.05);与模型组比较,犀角地黄汤合方低、中、高剂量组CD4^(+)T细胞增殖百分比、Teff细胞比例依次降低,Treg细胞比例、CD4^(+)T细胞表面PD-1表达量和抑炎因子IL-10、TGF-β升高(P<0.05),促炎因子IL-2的量降低(P<0.05);与模型组相比,犀角地黄汤合方中、高剂量组IFN-γ和IL-17降低(P<0.05)。结论 犀角地黄汤合方尤其是高剂量组含药血清能够在体外调节ITP患者CD4^(+)T细胞的过度增殖分化及细胞因子的分泌,这可能是犀角地黄汤合方治疗ITP机制之一。

基于网络药理学探讨犀角地黄汤合方治疗原发免疫性血小板减少症的作用机制

目的 运用网络药理学方法研究犀角地黄汤合方对原发免疫性血小板减少症(ITP)的作用机制。方法 通过TCMSP、TCM-ID、PharmMapper数据库获取犀角地黄汤合方的药物成分、成分靶点,通过OMIM、DrugBnak、DisGeNET、GeneCards、TTD数据库获取ITP的疾病靶点,通过jvenn平台获取中药与疾病的交集靶点,利用STRING数据库对上述交集靶点构建蛋白质相互作用关系(PPI)网络,以获取关键靶点。应用Cytoscape软件构建中药-活性成分-靶点并进行可视化分析,通过Metascape数据库进行基因本体(GO)功能和通路分析。结果 筛选出活性成分75个,交集靶点140个,主要活性成分包括槲皮素、山柰酚、丁香脂素二葡萄糖苷、β-谷甾醇、豆甾醇等,PPI网络中分析排名靠前的靶点包括非受体型酪氨酸蛋白激酶(SRC)、细胞肿瘤抗原p53(TP53)、肿瘤坏死因子(TNF)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)等;GO功能及KEGG富集分析结果:关键蛋白富集在膜微区、膜筏、囊泡腔等位置,参细胞运动及迁移等过程,关键靶点主要通过PI3K-AKT、IL-17信号通路等信号通路对ITP发挥作用。结论 犀角地黄汤合方可能通过槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇、丁香脂素二葡萄糖苷等化合物,经由SRC、TP53、TNF、MAPK1、MAPK14等靶点,通过PI3K-AKT、IL-17等信号通路发挥治疗ITP的作用。