冷冻保护剂对犊牛睾丸组织标志性酶活性的保护作用

为了探讨犊牛睾丸组织适宜的冷冻保存体系,设计以甘油、DMSO、乙二醇、海藻糖、BSA和睾丸液作为主要成分的6种冷冻保护液,以碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、乳酸脱氢酶(LDH)和β-D葡萄糖苷酶(β-D-Glucosidase)的酶活性作为测定指标,以新鲜犊牛睾丸组织的4种酶活性为空白对照,使用6种冷冻保护液将睾丸组织于液氮中冷冻保存7d,然后37℃水浴解冻并无菌培养24h,再制备成φ=10%的睾丸组织匀浆液并测定4种酶活性,最后分析6种冷冻保护液对犊牛睾丸组织标志性酶活性的冷冻保护效果。结果表明,含ρ=0.015g/mL牛血清白蛋白(BSA)的冷冻保护液冷冻7d后,睾丸组织AKP、ACP、LDH和β-D葡萄糖苷酶的活性分别为599.99、129.11、1 891.53和489.98U/g,均显著优于其他组(P<0.05);含ρ=0.04g/mL海藻糖的冷冻保护液冷冻7d后,AKP、ACP、LDH和β-D葡萄糖苷酶活性分别为454.88、114.63、1 862.79和457.8U/g,其保护效果次于0.015g/mL BSA组,但均显著优于其他组(P<0.05);经DMSO、乙二醇和睾丸液冷冻7d后,4种标志性酶的活性均低于0.015g/mL BSA组和0.04g/mL海藻糖组,甘油组冷冻保护液的效果最差。因此,含ρ=0.015g/mL BSA和ρ=0.04g/mL海藻糖的冷冻保护液能够较好地保护犊牛睾丸组织的酶活性,是犊牛睾丸组织适宜的冷冻保护剂。

新生犊牛睾丸细胞体外培养获取类EGC集落

在不同条件下培养新生犊牛睾丸细胞,3-4d生成类似胚胎生殖干细胞(EGC)集落,通过对集落进行形态学观察,免疫荧光细胞化学染色等技术,分析鉴定细胞集落是否为EG细胞集落或精原细胞过渡状态。

不同冷冻保护剂对犊牛睾丸组织冷冻效果的研究

通过探讨不同冷冻保护剂对犊牛睾丸组织冷冻保存的效果以及睾丸组织低损伤冷冻保存的机理,为保护珍稀濒危物种、恢复人类未成年男性生育能力等提供依据。研究将二甲基亚砜(DMSO)、甘油、丙二醇、蔗糖和葡萄籽原花青素(GSP)五种冷冻保护剂设置八个浓度梯度,用以进行犊牛睾丸组织的冷冻保存,7d后解冻,解冻后检测睾丸组织内的一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)和细胞活率。结果表明,经10%DMSO、丙二醇、蔗糖和GSP冷冻犊牛睾丸组织7d解冻后,组织细胞活率分别达到77%、62%、34%和24%,DMSO组优于其他组(P<0.05);NO水平分别为0.52、0.51、0.64和0.49μmol/mgprot,NOS活性分别为1.03、0.98、1.04和0.96U/mgprot,GSP组优于其他组(P<0.05)。7.5%甘油冷冻犊牛睾丸7d解冻后,细胞活率、NO和NOS分别为41%、0.54μmol/mgprot和1.07U/mgprot,优于组内其他浓度(P<0.05)。表明10%DMSO能有效地冷冻保存犊牛睾丸组织。

鸡痘鹌鹑化弱毒在犊牛睾丸细胞上的适应性试验

鸡痘鹌鹑化弱毒在犊牛睾丸细胞上培养传至7代,各代次均产生程度不同的致细胞病变作用,经测定至第6代病毒收获液在犊牛睾丸细胞(BTC)上的致病变作用(CPE)最明显,细胞产毒效价最高可达105.5EID50/0.2mL。另外,对7个代次的病毒液进行的安全试验结果表明,该病毒收获液安全有效,符合制苗标准。此试验为用BTC生产鸡痘活疫苗提供了重要依据。

猪瘟兔化弱毒犊牛睾丸细胞苗免疫程序研究

给空怀母猪免疫接种猪瘟兔化弱毒犊牛睾丸细胞苗１５００个兔感染量，以ＰＰＡ－ＥＬＩＳＡ监测其血清抗体。结果，ＥＬＩＳＡ效价ＯＤ值保护率６～７个月为１００％，８个月为７７．５％，表明１５００个兔感染量免疫母猪，一年应免疫接种２次，才能避免非免空隙，保持坚强免疫力。给怀孕母猪免疫，所产亲代仔猪的母源抗体消失很快，ＥＬＩＳＡ效价ＯＤ值保护率，１０日龄为９６．５％，２０日龄为７１．６％，３０日龄为４０％，４０日龄为１２．５％。给３０日龄仔猪免疫接种１５００个兔感染量，以ＰＰＡ－ＥＬＩＳＡ检测其免疫后６、７、８、９、１０个月的血清抗体，结果其ＥＬＩＳＡ效价ＯＤ值保护率６～９个月均为１００％，１０个月为９４％；攻ＨＣＶ强毒，６～１０个月均１００％保护。综上试验证明，仔猪３０日龄、母猪空怀免疫接种猪瘟兔化弱毒犊牛睾丸细胞苗１５００个兔感染量，是最佳的免疫程序。

用犊牛睾丸细胞生产羊口疮疫苗时应注意的问题

在采用犊牛睾丸细胞生产羊口疮疫苗时,睾丸组织采集方法、存放温度、存放时间、制作中使用的营养液和血清、种毒标准、接收毒时间等因素均可影响羊口疮疫苗的产量及质量。

犊牛睾丸细胞复制鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒的初步试验

犊牛睾丸细胞已用来生产猪瘟、狂犬病等家畜疫苗 ,此种细胞来源广泛 ,生产性能良好 ,且不受禽源致病微生物的污染 ,能否替代禽源 CEF细胞 ,所以我们进行了异源细胞的复制试验。结果表明 ,犊牛睾丸细胞可以复制鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒 ,但数量甚微。

对稳定和提高猪瘟兔化弱毒犊牛睾丸细胞复制毒毒价的探讨

我厂从一九八二年开始用犊牛睾丸细胞繁殖猪瘟兔化弱毒,经过七年来的研究,并进行了各种对比试验,证明用犊牛睾丸细胞复制猪瘟兔化弱毒是成功的,不但可以保证疫苗质量,确保安全,提高防预效果,且可降低成本。几年来,经过试验和扩大再生产,截至一九八八年底。

提高猪瘟犊牛睾丸细胞苗效价的探索

猪瘟兔化弱毒可以在犊牛睾丸细胞内不断复制,并以出芽的方式释放至培养液中,而不致细胞病变,在几年的生产中,我们通过合理调整影响细胞产毒的各个因素,可使收获的细胞毒液的兔体反应量由稀释5万倍、10万倍通过,提高到稀释20万倍,许多收次能达到稀释50万倍、100万倍兔检通过。

鸡痘鹌鹑化弱毒在犊牛睾丸细胞上的适应性试验

鸡痘鹌鹑化弱毒不仅能够在鸡胚成纤维细胞上复制,而且经过试验也可以在犊牛睾丸细胞(以下简称BTC)上复制。本试验结果表明鸡痘鹌鹑化弱毒在BTC上培养传代至第6代后,细胞产毒效价达105.5EID50/0.2mL左右,达到了《兽用生物制品规程》的制苗标准。这为试验用BTC代替SPF鸡胚生产鸡痘活疫苗提供了重要依据。

应用三代犊牛睾丸细胞生产猪瘟苗的试验

目前,国内生产猪瘟兔化弱毒犊牛睾丸细胞苗的常规方法,一直采用二代细胞(通常称之谓次代细胞)接毒的方法,然后每隔一定时间进行收毒,换液。为了批量生产和节约猪瘟中间监测所需费用,就要求每批接毒的转瓶数目不能太少。但有的地方由于犊牛睾丸来源困难以及受到产犊季节的限制,难以大批量生产。为了克服这些困难。

用犊牛睾丸细胞试制鸡法氏囊饮水苗的研究

鸡法氏囊（ＩＢＤ）饮水株病毒能在犊牛睾丸细胞（ＢＴＣ）上复制，并产生明显病变（ＣＰＥ）。所复制病毒ＥＬＤ５０／０１ｍｌ最高可达１０６０以上，经鉴定特异性不变，并可用于试制疫苗。

用液氮冷冻保存犊牛睾丸原质细胞

进行了液氮冷冻保存犊牛睾丸原质细胞的试验。共制备了3批冷冻细胞,每批均包括原质细胞、原代细胞和次代细胞,并将其分别放入I号冷冻液和II号冷冻液中冻存。试验表明,用冻存方法保存犊牛睾丸原质细胞是切实可行的,而且用I号冷冻液冻存细胞的复活率明显高于II号冷冻液。

猪瘟兔化弱毒犊牛睾丸细胞苗对经产母猪免疫期的测定

<正> 作者在研究了免疫母猪所产亲代仔猪,于28日龄左右用猪瘟兔化弱毒犊牛睾丸细胞苗(下称猪瘟犊睾细胞苗)760个对兔感染量进行免疫接种,免疫后304天时仍有理想的保护力之后,继续研究了该苗750个对兔感染量免疫经产母猪的免疫期。研究结果表明;用猪瘟犊睾细胞苗750个兔感染量免疫经产母猪,免疫后203天时,试验组和对照组的猪瘟间接血凝(IHA)滴度16~x及其以上的(保护滴度)均为100%,平均滴度分别为119.11和112。

猪瘟牛睾丸细胞苗的优化试验

本实验研究共生产猪瘟兔化弱毒细胞疫苗3批,以传统生产为基础,在原代细胞制备、病毒感染和收获3方面做了改进。试验证明,混合消化法、适当比例的脾毒与细胞毒混合接毒以及新维持液在带毒传代中的应用,能大大提高猪瘟细胞苗半成品的合格率。

山羊痘病毒AV41株在3种原代细胞上的培养特性比较

为了选择适合山羊痘病毒AV41株增殖的原代细胞,提高山羊痘病毒疫苗生产效率,分别采用常规方法制备绵羊睾丸细胞、绵羊肾细胞、犊牛睾丸细胞3种原代细胞,接种山羊痘病毒细胞弱毒AV41株进行传代培养,比较该病毒株在3种细胞上所引起的细胞病变时间、病变形态及其传代稳定性等增殖特性,并进行特异性、安全性、效力测定,试验结果显示,AV41株在3种原代细胞上均可增殖,其特异性、安全性均符合兽药典要求。疫苗株在以上3种细胞上的TCID50浓度分别达到10-6.125、10-5.5、10-5.875/mL,细胞病变形态、病变时间、最高传代次数等增殖特性存在一定差异。试验证明,原代绵羊肾细胞或原代犊牛睾丸细胞可以作为山羊痘病毒疫苗生产的候选细胞。

支持牛类胚胎干细胞发育的饲养层培养体系的建立

以小鼠胎儿和牛睾丸为材料 ,以含 1 5 % NBS、0 .1 mmol/ Lβ-巯基乙醇、0 .1 μmol/ L Na2 Se O3的DMEM溶液为培养液 ,分离获得了传 1 5代的小鼠胎儿成纤维细胞和 5代牛睾丸成纤维细胞 ,建立了小鼠和牛类 ES细胞培养体系。结果表明 :牛睾丸成纤维细胞和小鼠胎儿成纤维细胞均属附着生长型细胞 ,与小鼠胎儿成纤维细胞相比较 ,牛成纤维细胞直径和长度大 ,生长速度快 ,易于老化 ;1 2～ 1 6日龄的小鼠胎儿最适宜分离与克隆小鼠胎儿成纤维细胞 ;在 2 5℃条件下 ,以 0 .2 5 %胰蛋白酶 +0 .0 4% EDTA消化液作用胎儿小块组织分离原代小鼠胎儿成纤维细胞 ,消化液作用时间不应超过 2 0 min,以相同的消化液在 3 7℃条件下 ,离散贴壁成纤维细胞 ,作用时间以 2～ 3 min为宜 ;培养细胞密度与传代时间间隔有密切关系 ,若传代时间间隔为 3～ 4d,培养细胞浓度应为 3× 1 0 5个 / ml～ 5× 1 0 5个 / ml;在成纤维细胞分离与克隆过程中 ,培养基中添加0 .1μmol/ L Na2 Se O3+0 .1 mmol/ Lβ-巯基乙醇 +1 5 % NBS,有利于 MEF和

杨凌某羊场羊口疮病毒的分离鉴定

为获得杨凌地区羊口疮病毒野毒株,在某羊场采集具有典型羊口疮症状的病羊口唇部结痂并研磨,无菌过滤后取500μL接种于犊牛睾丸原代细胞。盲传4代,测定细胞病变的第5代病毒的滴度,用羊口疮病毒B2L和F1L基因的特异性引物进行PCR检测。结果显示,第5代病毒能够致犊牛睾丸原代细胞出现细胞病变(CPE),病毒滴度为107.66 TCID50/mL;扩增出了羊口疮病毒B2L和F1L基因的片段,其大小分别为540bp和437bp,与用于设计引物的参考毒株序列的相似度分别为96.57%和96.43%,可确定为羊口疮病毒的相应基因片段,获得了羊口疮病毒分离株。