犬冠状病毒、犬副流感病毒、犬传染性肝炎病毒和犬传染性喉气管炎病毒的研究进展

犬冠状病毒、犬传染性肝炎病毒、犬传染性喉气管炎病毒、犬副流感病毒是威胁犬健康的常见病原。犬冠状病毒是引起犬冠状病毒性腹泻的病原;犬副流感病毒是犬呼吸道疾病的主要病原之一,该病在全世界范围内广泛流行;犬腺病毒I型和II型是犬腺病毒的两种血清型。前者可引起犬传染性肝炎,后者则可导致犬传染性喉气管炎。以上四种病毒对养犬行业的危害巨大,文章对犬冠状病毒、犬副流感病毒、犬传染性肝炎病毒和犬传染性喉气管炎病毒四种病毒的研究进展进行了综述,以求更好地研究这四种病毒。

犬传染性喉气管炎病毒的分离及鉴定

用犬肾细胞 (MDCK)从疑似犬传染性喉气管炎病毒感染犬的急性期血清中分离到 1株病毒 ,经血凝试验、免疫电镜观察、中和试验、免疫荧光抗体试验、细胞培养特征观察和回归动物试验等鉴定 ,证明所分离的病毒为犬传染性喉气管炎病毒 ,命名为 BJ- JB- 3。

表达鸡传染性喉气管炎病毒gD蛋白的重组嵌合型新城疫病毒La Sota株的构建

为构建表达鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)糖蛋白D(gD)的重组新城疫病毒(NDV)La Sota株,本研究将ILTV强毒株gD基因胞外域与NDV F基因信号肽、跨膜域和胞质尾区融合,并插入到含有NDV基因VII型F和HN基因的嵌合型La Sota株感染性cDNA克隆pLa Sota-VIIF/HN的P和M基因之间,将获得的重组感染性克隆pLa Sota-VIIF/HN-gD与辅助质粒pCIneo-NP-P-L共转染BHK-21细胞,拯救出表达gD蛋白的重组嵌合型NDV La Sota株rLaSota-VIIF/HN-gD,并采用血凝试验鉴定正确后,将重组病毒在9日龄SPF鸡胚中连续传至10代,提取10代重组病毒基因组RNA,反转录成c DNA作为模板,以ILTV gD基因插入位点两侧的鉴定引物进行PCR鉴定;采用第10代重组病毒感染BHK-21细胞,以ILTV gD蛋白多克隆抗体作为一抗进行间接免疫荧光试验(IFA);分别对鸡红细胞吸附的重组病毒感染的鸡胚尿囊液上清和从红细胞上解离下来的纯化的重组NDV病毒粒子经western blot鉴定,并对重组病毒对鸡胚的致病性和在鸡胚中的复制动态进行初步研究。PCR结果显示ILTV gD基因能够在重组病毒中稳定存在;IFA和western blot鉴定结果显示,重组病毒能够正确表达ILTV的gD蛋白,而且gD蛋白嵌合表达在重组病毒颗粒上。鸡胚致病性试验和鸡胚中的复制动态试验结果显示,重组病毒保持了La Sota疫苗株的低致病性和良好的复制特性,rLaSota-VIIF/HN-gD的鸡胚平均死亡时间(MDT)为168 h,1日龄雏鸡脑内接种该重组病毒的致病指数(ICPI)为0.20,鸡胚半数感染量(EID_(50))峰值可达10^(-8.66)/100μL。本研究所制备的重组病毒r LaSota-VIIF/HN-gD为研制基因VII型NDV和ILTV的二联活疫苗奠定了基础。

药理激活p38/MAPK体外抗传染性喉气管炎病毒效应的检测

鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)是一种严重危害我国和世界养禽业的重要病原。本研究以ILTV-LJS09株感染的鸡LMH细胞系作为研究模型,对该病毒的全基因组转录谱分析,采用基因富集分析(GSEA)分析细胞中的信号通路。结果发现MAPK通路是ILTV感染LMH细胞后最显著激活的通路。进一步采用western blot鉴定,结果显示ILTV感染可以显著激活宿主细胞p38/MAPK信号通路。本研究同时采用脱氢紫堇碱(DHC)和佛波酯(PMA)作为p38/MAPK激活剂,采用特异性荧光定量PCR检测病毒基因组拷贝数,通过测定病毒的TCID_(50)检测病毒滴度,利用荧光定量PCR检测细胞中代谢相关基因的转录水平,使用高内涵成像技术结合Annexin V-FITC/碘化丙啶双染法检测细胞凋亡,从而探究药理激活p38/MAPK对ILTV感染的影响。病毒特异性荧光定量PCR检测结果显示,DHC和PMA均显著降低ILTV基因组的复制(P<0.05)。TCID_(50)测定结果显示,DHC和PMA还显著抑制ILTV感染性病毒粒子的增殖(P<0.05)。荧光定量PCR检测结果显示,无论DHC还是PMA对感染细胞代谢基因的总体转录水平均无明显影响。高内涵成像技术检测结果显示,DHC和PMA显著加剧ILTV感染细胞的凋亡(P<0.05)。综上所述,本研究结果显示DHC和PMA均能够在不影响感染细胞代谢基因表达的情况下,通过加剧ILTV感染细胞的凋亡有效抑制ILTV的感染。本研究在ILTV体外感染模型中证明药理激活p38/MAPK信号通路具有高效的抗病毒作用,为治疗ILTV的感染提供了新的思路,对其他疱疹病毒感染的防治研究也具有借鉴意义。

鸡传染性喉气管炎病毒微滴式数字PCR定量检测方法的建立

旨在建立检测鸡传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus, ILTV)绝对定量方法。根据已发表的鸡ILTV的TK基因序列,针对其保守区域分别设计1对特异引物和1条探针,建立检测鸡ILTV的微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果显示,建立方法的最佳引物浓度为20μmol/μL,最佳探针浓度为10μmol/μL,最佳退火温度为56℃。特异性检测结果显示,建立的方法只检出ILTV,没有检出其他病原株。敏感性检测结果显示,采用建立的方法定量检出ILTV重组质粒标准品的最低限为4.6拷贝/μL。对3个连续稀释的pMD18-ILTV重组质粒DNA进行检测,3次重复检测结果的变异系数均小于5%。对83份病鸡喉拭子、肺及脾组织样品进行检测,采用建立的ddPCR检出ILTV阳性样品10份,荧光定量PCR检出ILTV阳性样品9份,ddPCR的阳性检出率(12.05%)高于荧光定量PCR的阳性检出率(10.84%)。结果表明,建立的ddPCR方法定量检测ILTV特异性强、敏感性高、重复性好,为绝对定量检测ILTV提供更好的技术支撑。

1株鸡传染性喉气管炎病毒的分离鉴定及致病性评价

研究旨在为当前国内鸡传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus,ILTV)的流行情况调查及相关疫苗研发提供参考。河南省濮阳市某养鸡场的蛋鸡疑似感染ILTV,将阳性病料处理后接种鸡胚绒毛尿囊膜,盲传3代后产物进行PCR鉴定和TK、gD基因序列测定分析,并通过动物回归试验初步研究分离株的致病性。结果显示,盲传3代后绒毛尿囊膜出现痘斑、增厚现象,产物PCR鉴定结果为阳性,将其命名为PY株。PY株TK、gD核苷酸序列与GenBank发表的ILTV序列相似性分别为99.4%~100.0%、99.1%~100.0%。49日龄SPF鸡于攻毒后第3 d出现鸡传染性喉气管炎的典型临床症状,剖检病死鸡可见喉头气管内充满血样黏液。攻毒后鸡发病率为100%、死亡率为30%。研究表明,分离株PY株是一株致病力较强的ILTV。

应用多重聚合酶链反应同时检测鉴别鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒和鸡毒支原体的研究

本文建立了一种同时检测NDV、IBV、ILTV和MG 4种病原体的多重PCR技术。根据NDV、IBV、ILTV和MG的基因文库 ,设计了 4对分别与NDV、IBV、ILTV和MG某段基因序列互补的引物 ,用这 4对引物对同一样品中的NDV、IBV、ILTV、MGRVA或DNA模板进行多重PCR扩增 ,结果均同时得到了 4条特异性大小与实验设计相符的 310bp(NDV)、172 0bp(IBV)、6 47bp(ILTV)、和 732bp(MG)多重PCR扩增带 ,而对其他 6种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性 ;敏感性测定结果表明 ,该多重PCR技术能检出 10pg的IBV、1pg的NDVRNA模板和 10pg的ILTV、1pg的MGDNA模板。

传染性喉气管炎病毒王岗株糖蛋白gB基因在重组杆状病毒中的表达

将克隆到pUC119中的传染性喉气管炎病毒 (ILTV)糖蛋白gB基因 ,通过EcoRI位点亚克隆到杆状病毒转移载体pVL1393中 ,构建成重组杆状病毒转移载体rpVLgB。将rpVLgB转移载体质粒与杆状病毒DNA(Bac_N_BlueDNA)共转染Sf9昆虫细胞 ,经 3轮蚀斑纯化 ,获得重组病毒并命名为rpVL_ILTVgB。PCR方法鉴定证明gB基因正确插入到杆状病毒基因组中 ,直接免疫荧光试验和Dot_ELISA结果均表明gB基因在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中获得表达 ,表达的gB蛋白将作为鸡传染性喉气管炎的亚单位疫苗和诊断抗原。

表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒疫苗的遗传稳定性评价

为了检测表达鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因重组鸡痘病毒 (rFPV -ILTVgB)的稳定性 ,我们对重组病毒进行 6代和 16代克隆纯化 ,对纯化后的病毒通过转瓶连续培养传 2 0代。结果发现第 6代纯化病毒 (rFPV -ILTVgB -C6)在传代过程中有白斑出现 ,说明病毒纯度不够 ;经过 16代纯化的病毒 (rFPV -ILTVgB -C16)对细胞的嗜性加强 ,病毒的效价进一步升高 ,2 0代传代后蓝斑率仍然为 10 0 % ,PCR的检测进一步证明插入的外源基因能在病毒的长期传代过程中稳定地遗传。抽取病毒细胞传代过程中的第 5 ,10 ,15 ,2 0代次的病毒翅膀内侧无血管处皮下接种 2周龄SPF鸡 ,2 0天后分为两组 ,分别用传染性喉气管炎病毒WG株和鸡痘病毒 10 2株攻击 ,结果不同代次的重组病毒均可以使免疫鸡抵抗传染性喉气管炎病毒和鸡痘病毒强毒的攻击。鸡体内病毒传代试验表明 ,重组病毒在接种部位仅存在 6天 ,之后就检测不到病毒 ,重组病毒通过SPF鸡连续传代 ,不存在病毒返祖的可能。由此可以得出一个结论 ,rFPV -ILTVgB在结构上和免疫原性上是稳定的 ,无论是在体外传代 ,还是在体内均可以稳定遗传 ,不存在因为接种重组疫苗而给免疫鸡群带来安全威胁的可能 ,完全可以作为疫苗毒株进行商品化开发。

抗鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗同居感染试验

疫苗的接触传播是疫苗免疫接种需要考虑的重要因素,为了检测重组鸡痘病毒载体疫苗水平传播的能力,对隔离条件下饲养的SPF鸡用重组鸡痘病毒基因工程疫苗接种,同时设立非免疫对照鸡,饲养期间特意延长清粪时间以增加感染的机会,1个月之后攻击传染性喉气管炎WG株强毒和鸡痘102株强毒,疫苗免疫鸡全部获得保护,而非免疫鸡则全部发病。在试验动物饲养场的自然条件下,将免疫鸡和试验对照两组鸡饲养在同一个鸡舍内,让疫苗毒的传播更接近自然条件。在每个月的攻毒试验中,对照鸡都没有获得对鸡痘和传染性喉气管炎强毒的保护。在疫苗免疫期间进行连续5个月的跟踪检测,同居未免疫鸡没有检测到抗传染性喉气管炎病毒gB抗体。这些实验结果表明抗鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗不能通过接触传播。

表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒疫苗的安全性试验与最小免疫剂量测定

将表达鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因的重组鸡痘病毒 (rFPV_ILTVgB)通过鸡胚成纤维细胞培养 ,加入适当的保护剂制成冻干疫苗。取 3批冻干疫苗 ,生理盐水稀释后分别经翅内侧无血管处皮下接种 14日龄和 5 0日龄SPF鸡 ,接种剂量为 5× 10 6 PFU ,接种后 3天出现局部反应 ,5天局部肿胀达到最大 ,接种鸡无其它全身反应 ,精神、食欲以及发育等均不受影响 ,说明重组病毒对试验鸡是安全的。取其中的 2 0 0 0 0 3批疫苗 ,用生理盐水作 2 10 -2 ～ 2 10 -5稀释后 ,翅内侧无血管处皮下接种 4 0日龄SPF鸡 ,免疫后 4周分别攻击传染性喉气管炎病毒WG株和鸡痘病毒 10 2株 ,结果表明 ,重组病毒对试验鸡翅内侧皮下接种能产生良好的免疫力 ,在接种剂量为 2 10 -2 ～ 2 10 -40 .1ml/鸡的范围内可以使全部试验鸡产生局部反应 ,当接种剂量为 2 10 -50 .2ml/鸡时可以使部分试验鸡 ( 5 /15 )产生局部反应 ,鸡体对重组疫苗的最小反应剂量为 2 10 -40 .1ml(相当于 10 0 0PFU)。攻毒试验结果进一步证明 ,当接种剂量为 2 10 -40 .1ml(相当于 10 0 0PFU)时可以使免疫鸡产生可靠免疫力 ,抵抗传染性喉气管炎病毒WG株强毒和鸡痘病毒 10 2株的攻击 ,降低鸡群的发病率和病死率。这些结果说明 。

传染性喉气管炎病毒烟台株TK基因序列测定及TK蛋白功能初步分析

根据传染性喉气管炎病毒(ILTV)美国632株TK基因序列设计并合成1对引物,以ILTV烟台株DNA为模板扩增了TK基因,并对其进行了序列测定.将ILTV烟台株的TK基因和TK蛋白分别与ILTV美国632株,英国Thorne株,Beijing E2株,BHV-1,EHV-1,EHV-2,FHV-1,HHV-1,HHV-2,HHV-3,HHV-4,HVT,MDV-1,MDV-2,PRV和SHV-2的TK基因和TK蛋白比较后发现,其TK基因的核苷酸和TK蛋白的氨基酸同源性分别为24.6%～99.5%和15.1%～98.9%,表明不同ILTV毒株之间TK基因和TK蛋白相对保守,但与其他α-疱疹病毒的TK基因和TK蛋白同源性则较低.

鸡传染性喉气管炎病毒DNA疫苗免疫效果观察

将分别构建的含有鸡传染性喉气管炎病毒王岗株gB、gC和gD基因的重组真核表达质粒及空载体质粒分组肌肉注射雏鸡 ,攻毒后观察免疫保护效果。结果表明 ,重组质粒诱导了免疫应答 ,免疫保护率为 79% 。

一株鸡传染性喉气管炎病毒的分离鉴定及TK基因分析

黑龙江省牡丹江市某养鸡场28周龄蛋鸡发生以呼吸困难、咳血和产蛋下降为主要症状的疾病。本研究利用特异性引物,从发病鸡喉头及其分泌物中扩增出鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)gB基因的567 bp大小片段;将发病鸡喉头及分泌物处理后接种鸡胚,在鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)上形成痘斑。病毒接种鸡胚肾细胞48 h后电镜下可以观察到典型的疱疹病毒粒子形态,并且该分离株能够与ILTV单克隆抗体发生特异性反应。动物回归试验显示,感染的SPF鸡出现典型ILT症状,并能够从发病鸡体内重新分离到ILTV,由此判定该分离株为ILTV,并将其命名为MDJ0442。根据NCBI登录的ILTV序列(HQ630064)设计引物,以MDJ0442基因组为模板,PCR扩增TK的基因片段,进行测序和序列分析。结果表明,与其他ILTV参考病毒株相比,TK基因的核酸同源性为99.62%。本研究可以为ILTV的流行病学调查和分子生物学研究提供参考。

表达传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒疫苗免疫持续期试验

用表达传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒(rFPV-gB-F)制备的疫苗免疫4周龄SPF鸡,免疫后的7、14、21、30、60、90、120、150、180 d分别采血,分离血清,检测抗FPV和gB的抗体。结果表明重组疫苗免疫后14 d,免疫鸡血清抗体已经全部阳转,免疫后的21 d血清抗FPV的抗体出现峰值;此后便开始回落,到免疫后的6个月抗体水平已经接近阴性对照的水平。抗gB的抗体在免疫后的第二周达到阳性,之后的六个月都为阳性。在免疫后的每个月将免疫鸡取20只再分成两组,分别用新城疫强毒与传染性喉气管炎强毒的攻击。在免疫后的第一个月对新城疫的保护率为8/10,第2个月对新城疫的保护为7/10,第3个月为2/10,因此对新城疫的免疫保护期为2个月。在免疫后的5个月内可以使免疫鸡对传染性喉气管炎强毒攻击的保护率达到8/10以上,免疫后的6个月对ILT为8/13,因此rF-PV-gB-F对传染性喉气管炎的免疫保护期为5个月。

鸡传染性喉气管炎病毒PCR快速检测方法的建立

根据GenBank发表的传染性喉气管炎病毒(ILTV)TK基因序列(EF552578),设计合成了1对特异性引物,通过优化反应条件,成功地从ILTV疫苗株中扩增出329 bp特异性片段,而传染性支气管炎病毒、新城疫病毒及马立克病毒基因组均未扩增为出相应的片段。回收的PCR产物经EcoRⅠ酶切和测序鉴定,证实了该扩增片段的特异性。PCR检测ILTV DNA的最小检测量为30 pg。经临床初步应用表明,该方法的建立使传染性喉气管炎病毒的检测更为快速、简便、经济和实用。

表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒疫苗免疫持续期试验

将200003批疫苗免疫4周龄SPF鸡,免疫后的7、14、21、30、60、90、120、150、180和225d分别采血,分离血清,采用ELISA方法检测血清抗FPV抗体,结果表明重组疫苗免疫后14d,免疫鸡血清抗体已经全部阳转,免疫后的21d血清抗FPV的抗体出现峰值,此后便开始下降,到免疫后的6个月抗体水平已经接近阴性对照的水平。用ILTVWG株和FPV102株强毒进行的攻毒保护试验与血清检测的结果基本一致,在免疫后的5个月内可以使免疫鸡获得100%(10/10)保护,免疫后的6个月对ILT和FP的免疫保护分别为1/7和2/10,此时需要对鸡群实施二次免疫。其他5批疫苗(200001、200002、200101、200102和200103)免疫SPF鸡后5个月用ILTVWG株和FPV102株攻击也获得了完全保护。

传染性喉气管炎病毒基因疫苗免疫效应

以传染性喉气管炎病毒(ILTV)WG株gB和gD基因为目的基因构建真核表达质粒pCAGG-gB和pCAGG-gD。将75只SPF鸡随机分为7组,经肌肉注射接种pCAGG-gB、pCAGG-gD、pCAGG-gB+pCAGG-gD、pCAGG-gB+rFPV-ILTVgB以及rFPV-ILTVgB,并设有生理盐水和空载体(pCAGG)对照组。免疫2周后以500EID50ILTV WG株强毒进行攻击,以评价ILTV基因疫苗以及基因疫苗和重组病毒联合应用对SPF鸡的免疫保护作用。血清抗体的检测表明:在免疫后的2周,各免疫组的鸡只均产生了特异性的ILTV抗体,外周血CD4+T、CD8+T、TCRγδ+T细胞明显高于对照组,并且pCAGG-gB和pCAGG-gD分别诱导了高水平的IL-18和IFN-γ的表达。ILTV强毒攻击后,非免疫鸡全部发病,并在第2天出现死亡。而各质粒免疫组均获得了一定的保护(保护率44%),两种质粒联合免疫(pCAGG-gB和pCAGG-gD)和重组病毒(rFPV-ILTVgB)与质粒(pCAGG-gB)联合免疫的免疫组的保护率(56%)高于单独免疫组,产生高水平细胞因子表达的免疫组的保护率高于对照组。重组鸡痘病毒免疫组的保护率(69%)最高。这些结果表明ILTV的DNA疫苗能够诱导鸡体产生特异性免疫应答,并能对传染性喉气管炎强毒的攻击提供一定的免疫保护。

鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)王岗株糖蛋白gB基因序列比较分析

根据已经发表的鸡传染性喉气管炎病毒 ( ILTV) SA2 株的 g B基因序列 ,设计了 1对引物 ,通过 PCR扩增了 ILTV王岗株的 g B基因 ,并克隆到 p UC1 1 9质粒的 Eco R 位点中 ,经酶切鉴定证实后 ,进行了序列测定。结果表明 ,g B基因长 2 6 1 9bp,包含完整的阅读框架。序列比较分析表明 ,ILTV王岗株的 g B基因核苷酸序列与英国的 Throne882和美国的 6 32 2个强毒株的 g B基因序列完全一致 ,而与澳大利亚 SA2 疫苗株g B基因核苷酸同一性为 99.8% ,氨基酸的同一性为 98.4 %。与澳大利亚 SA2 疫苗株 g B基因核苷酸和氨基酸序列比较发现 ,ILTV 3个强毒株 (王岗株 ,Throne 882株和 6 32株 ) g B基因的核苷酸序列在第 89位上均缺失 1个碱基 G,而在第 1 0 2位核苷酸处又插入了 1个碱基 A,从而引起了在氨基酸序列中第 2 9～ 32位 5个氨基酸的移码突变。

鸡传染性喉气管炎病毒TaqMan real-time PCR检测方法的建立

为建立鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)TaqMan Real-time PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的ILTV gB基因序列设计了2对引物与一条特异性TaqMan探针,通过对反应体系和反应条件的优化,特异性、敏感性以及重复性试验,证明该方法在核酸含量108拷贝/μL～101拷贝/μL范围内具有良好的线性关系;能够检测初始模板中10-3EID50的病毒核酸及16拷贝的标准品;与其它相关的鸡源病毒均无交叉反应,并且批内、批间变异系数均小于2%,具有良好的重复性。该检测方法的建立为ILTV的临床检测和定量分析提供了一种快速、准确的技术手段。