犬冠状病毒S1蛋白特异性小分子抗体Fab的制备

为表达犬冠状病毒(canine coronavirus,CCV)S1蛋白,制备其特异性小分子抗体Fab,为CCV的防治提供新材料。采用PCR扩增CCV S 1基因全长及其截短片段,分别克隆到原核表达载体pET28a或pGEX4T-1中,转到BL21(DE3)或Rosetta(DE3)感受态细胞构建重组表达菌株;用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达,通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot鉴定分析重组蛋白;纯化蛋白分别与ISA71AVG或ISA201VG佐剂配伍乳化后制备免疫原,免疫蛋鸡,用聚乙二醇(PEG)沉淀法提取得到CCV S1蛋白的卵黄抗体,通过Western blot检测抗体滴度,用胃蛋白酶水解卵黄抗体制备小分子抗体Fab。结果显示,S1蛋白全长无表达,CCV S1-a和CCV S1-b分子量分别为79 ku和68 ku。在免疫后第35天2种佐剂组的卵黄抗体滴度可达1∶128000。制备小分子抗体Fab最佳酶切条件为卵黄抗体与胃蛋白酶混合质量比20∶1、pH值4.1、37℃酶切8 h。完整的IgY可以与CCV呈特异性反应,胃蛋白酶处理后制备的小分子抗体Fab可以有效阻断CCV的感染性。综上,本研究成功表达了CCV S1的2个截短片段蛋白,制备了卵黄抗体及其小分子抗体Fab,为进一步开展犬冠状病毒病的诊断和防治技术研究奠定了基础。

一例犬冠状病毒与毛滴虫混合感染的诊治

犬冠状病毒病是一种以急性胃肠炎为主要症状的高度接触性传染病,幼犬的发病率和死亡率最高,防控该病最有效的措施是定期接种疫苗。犬毛滴虫病是毛滴虫寄生在犬肠道内的一种原虫性疾病,主要引起犬出现腹泻症状,主要预防措施是犬在幼年适宜时期进行全面体检和按时驱虫,值得关注的是寄生于犬的毛滴虫虫种可能均具有一定的人兽共患传播潜力。现就一例犬冠状病毒与毛滴虫混合感染病例的诊断及综合治疗进行总结,为该类疾病的诊治提供参考。

一例犬冠状病毒病的病例报告

犬冠状病毒病是由犬冠状病毒引起的一种临床上以呕吐、腹泻、脱水及易复发为特性的高度接触性传染病。该病对幼犬危害严重,如诊断和治疗不及时,容易导致犬只死亡。就一例犬冠状病毒病的临床诊断及治疗方案进行总结,为提高该病的诊断及治疗水平提供参考。

犬冠状病毒时间分辨免疫荧光分析方法的建立及初步应用

探索建立犬冠状病毒(CCV)的时间分辨免疫荧光分析(TRFIA)方法并制备试剂盒,并对试剂盒的性能进行初步的评价。本研究将抗CCV的单克隆抗体(MAb)8D6作为包被抗体,用Eu^(3+)标记的7E10 mAb作为检测抗体,制备双抗体夹心法TRFIA试剂盒,并对试剂盒的准确度、特异性、重复性、稳定性、临床样本检测等性能进行评估。本研究制备的CCV时间分辨免疫荧光试剂盒灵敏度为0.68 ng/mL;各浓度CCV标准品在不同水平的稀释度回收率在94.6%~105.6%;同步检测CPV、CD、CPIV、CAV-1标准品均为阴性,特异性好;批内CV为1.91%~5.03%,批间CV为1.82%~6.03%,重复性好;试剂盒在4℃保存6个月,37℃保存7 d后,试剂盒各项性能均无明显变化;临床样本检测结果与RT-PCR方法结果一致。本研究制备的CCV TRFIA试剂盒具有灵敏度、准确度高,重复性、稳定性良好的优点,能够对CCV的临床样本进行大量的筛查,为CCV患病犬的早期确诊提供了一种全新的技术手段。

犬瘟热病毒与犬冠状病毒双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立鉴别检测犬瘟热病毒(CDV)和犬冠状病毒(CCoV)的方法,本研究采用PCR方法分别扩增CDV N基因和CCoV S基因,并克隆至pMD18-T载体中构建重组质粒pCDV-N、pCCoV-S,均经PCR和测序鉴定后测定浓度作为质粒标准品。同时针对CDV N基因和CCoV S基因设计特异性引物和TaqMan探针,采用方阵试验对各反应条件的优化,建立了同时检测这两种病毒的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。利用10倍倍比稀释的质粒标准品按照该方法检测,建立标准曲线,结果显示,两个重组质粒标准品均与各自的Ct值具有良好的线性关系。采用该方法分别检测CDV、CCoV、犬细小病毒、犬传染性喉气管炎病毒2型、犬副流感病毒,评估该方法的特异性;将两种质粒标准品分别10倍倍比稀释并等体积混合后,取108~101稀释度的质粒混合物作为模板,采用该方法检测,评估该方法的敏感性;将两种质粒标准品10倍倍比稀释并等体积混合后,分别取107、105、103稀释度的质粒标准品混合物采用该方法检测,评估该方法的重复性。结果显示,该方法仅能特异性扩增CDV和CCoV,与犬的其他病毒均无交叉反应,特异性较强;对CDV质粒标准品的检测限为5.0×103拷贝/μL,对CCoV质粒标准品的检测限为4.93×103拷贝/μL,敏感性较高;组内和组间的变异系数均小于3%,重复性较好。利用本实验建立的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法和已报道的CCoV RT-PCR及国标规定的CDV RT-PCR方法同时检测采集的100份临床腹泻犬样品,结果显示,共检出35份阳性样品,其中,CDV的阳性检出率为16%(16/100),CCoV的阳性检出率为19%(19/100),阴性样品65份,与CCoV和CDV参考方法的检测结果均一致。本研究建立的CDV和CCoV双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法可在40 min内完成检测,且准确、快速、敏感,为CDV和CCoV临床大量样品的快速和特异性鉴别检测提供了有效技术手段。

江苏省常州地区犬冠状病毒病的流行病学调查分析

本研究采集常州地区3家宠物医院106例犬粪便和肛拭子,经胶体金和RT-PCR鉴定共检出45例犬冠状病毒(CCV)阳性病例,阳性检出率达到42.45%。对发病月份以及发病月龄进行统计学分析发现,1-3月龄幼犬属于CCV高发群体,阳性检出率可达44.44%;发病月份主要集中在冬春两季(10月~次年3月),发病率合计86.67%。感染犬常表现肠道症状,临床主要可见以腹泻为主。未经接种疫苗或者疫苗接种程序不完全的犬感染CCV概率远高于接种完成的犬。调查结果表明,常州地区宠物犬对犬冠状病毒病的感染率较高,需引起足够的重视。

犬冠状病毒病的诊断与防治

犬冠状病毒是一种引起犬不同程度胃肠道炎症的传染性病原,犬感染犬冠状病毒后主要出现呕吐、腹泻等临床症状,所有年龄犬中幼犬最易感染。近年来犬冠状病毒病的感染率居高不下,已成为影响宠物犬及试验犬集约化养殖的重要传染病之一。文章从犬冠状病毒的流行病学、致病机制、临床症状、诊断方法及防治措施等方面进行综述,以期为犬冠状病毒的防治及研究提供参考。

一例犬冠状病毒Ⅰ型与犬腺病毒Ⅱ型混合感染的实验室诊断

本试验对1例2月龄中华田园犬进行病原诊断,该病犬主要症状为腹泻、血便并伴随流涕、打喷嚏、咳嗽等。采集其鼻拭子、肛门拭子,利用PCR方法分别对7种常见的犬腹泻病毒及呼吸道病毒进行检测,结果显示该病例为犬冠状病毒Ⅰ型与犬腺病毒Ⅱ型的混合感染。待病犬进入濒死期立即安乐死并进行剖检,组织观察可见肺部出现明显的出血斑,盲肠、直肠、结肠有明显的出血点。本试验为犬病毒性腹泻、呼吸道疾病的病毒诊断以及犬冠状病毒Ⅰ型、犬腺病毒Ⅱ型自然感染引起的组织病变提供了参考。

犬冠状病毒病的诊断技术及治疗措施

冠状病毒是广泛存在于自然界的一大类病毒,可感染人、犬、猫和家禽等脊椎动物,导致严重的呼吸道、消化道及神经系统疾病。犬冠状病毒主要导致犬只发生急性肠胃炎,严重可导致犬死亡,给犬类养殖造成严重经济损失。本文主要从病原体特征、流行病学、致病机制、临床症状、临床诊断、实验室诊断及防治措施等对犬冠状病毒做一概述。希望可以为犬养殖业诊断和防治该病带来一定参考。

犬细小病毒、犬冠状病毒和犬轮状病毒三重PCR方法的建立及初步应用

犬细小病毒(Canine parvovirus, CPV)、犬冠状病毒(Canine coronavirus, CCoV)和犬轮状病毒(Canine rotavirus, CRV)是引起犬腹泻的主要病原.3种病原引发的疾病临床症状相似,难以诊断,因此需要建立可以高效鉴别这3种病原的分子检测方法.通过对引物浓度、退火温度的条件优化,建立了可同时检测CPV、CCoV和CRV 3种病毒的三重PCR方法,并进行特异性、敏感性和重复性试验.结果显示,该方法可特异性扩增CPV VP2基因(253 bp)、CCoV ORF-1b基因(379 bp)和CRV VP6基因(852 bp)的目的片段,未检出其他相关病原;对CPV、CCoV和CRV的最低检测浓度分别为6.44×10^(-1)pg/μL、8.72×10^(-1)pg/μL和8.35×10^(-1)pg/μL,方法的灵敏度高;重复性试验显示该方法具有良好的稳定性.应用建立的三重PCR方法对2019~2020年成都市区采集的135份犬腹泻粪便样本进行了检测,并与单重PCR检测结果相比较.结果显示CPV、CCoV和CRV的检出率分别为16.30%、20.74%和4.44%;总感染率为51.11%(65/135)),其中多病原混合感染率为20.00%(13/65),检测结果与单重PCR相符.建立的三重PCR方法,可以用于相关病原的临床检测和流行病学调查.

犬冠状病毒病的流行病学、症状、诊断与防治

犬冠状病毒在世界范围内多有流行,其潜伏期1~8d。本病传染迅速,数日内可蔓延全群。且随着日龄的增长,死亡率降低,是威胁犬类健康的重大传染性疾病之一。本文探讨犬冠状病毒的流行病学、临床症状、诊断及有效防治。旨在为犬冠状病毒的综合防治提供一些参考思路。

犬冠状病毒病的诊断与防治

犬冠状病毒病(CCV)是近年来常见的一种犬科动物感染的高度接触性传染病,该病毒主要存在于病犬的胃肠道内,可使犬发生程度不同的胃肠道症状,少数犬会出现呼吸道症状。本病以冬季多发,病犬是主要的传染源。该病一旦发生,可快速传播,数日内即可感染全群。通常幼犬最先发病,因此幼犬及小型犬种症状最严重,病情可能会急性发作,2 d内即可导致死亡。

犬瘟热、犬冠状病毒联合RT-PCR检测方法的建立及应用

用CDV、CCV特异性引物对同一样品中CDV和CCVRNA模板进行联合RT PCR扩增 ,并对扩增条件进行了优化。结果同时得到了两条大小与试验设计完全相符的特异性扩增带 ,且不扩增犬细小病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒、轮状病毒的核酸。敏感性试验表明 ,该联合PCR能检测出 10 - 4倍稀释的CDV模板 (10 6 6 TCID50 / 0 1mL)和 10 - 3倍稀释的CCV模板 (10 5 9TCID50 /0 1mL)。通过对 7份临床发病犬病料的检测 ,其阳性检出率高于电镜负染检查。初步应用表明 ,此法具有高度敏感、特异、准确、快速等特点 ,适用于兽医临床对CDV。

大熊猫犬冠状病毒的分离与鉴定

以犬肾传代细胞(MDCK)从1只病死大熊猫肝脏中分离到1株病毒,命名为DXMV。电镜观察磷钨酸负染的病毒细胞培养物,发现冠状病毒样粒子,超薄切片上可见细胞浆内病毒包涵体。理化学和生物学鉴定结果表明,DXMV核酸类型为RNA,对氯仿、乙醚敏感,可耐受1%胰蛋白酶的作用,具有一定的耐酸性和耐热性,可在MDCK、FCWF、F81细胞中增殖,无血凝性和血吸附特性。血清中和试验结果表明,DXMV可被犬冠状病毒阳性血清中和。采用犬冠状病毒间接荧光抗体法染色DXMV细胞飞片,可在细胞浆内见到特异性荧光。以冠状病毒通用引物和犬冠状病毒特异性引物,可从大熊猫肝脏和不同代次的病毒细胞培养物中扩增出与预期值251bp和515bp大小相同的核苷酸片段。由此说明,该病毒为犬冠状病毒,大熊猫可被犬冠状病毒感染。

犬冠状病毒的分离鉴定及其纤突蛋白基因的克隆与序列比较

以犬胎原代细胞，采用同步接种、带毒传代和添加新细胞的方法，从１例腹泻犬脾脏和１例临床健康犬肠内容物中分离出２株犬冠状病毒（ＣＣＶＹＳ１，ＣＣＶＣＩ１）。该２株病毒可使ＣＲＦＫ细胞出现典型的细胞融合病变，与从美国引进的ＣＣＶＮＬ－１８参考株形成的细胞病变相似；电镜负染和超薄切片观察，分离毒株细胞培养物中均含有典型的冠状病毒粒子，并形成胞浆内包涵体；经理化学、生物学鉴定，具有ＣＣＶ的特性；间接免疫荧光试验鉴定，证明为ＣＣＶ；动物回归试验证明，ＣＣＶＹＳ１毒力较强，ＣＣＶＣＩ１毒力较弱。利用ＲＴ－ＰＣＲ技术，分别扩增了ＣＣＶＮＬ－１８、ＣＣＶＹＳ１和ＣＣＶＣＩ１株纤突蛋白（Ｓ）主要功能区基因片段，经克隆、序列测定、计算机比较核苷酸和推导的氨基酸序列，结果为：（１）ＣＣＶＹＳ１和ＣＣＶＣＩ１与国外发表的Ｋ３７８等５株ＣＣＶ和ＣＣＶＭＬ－１８株的同源性为９１．７％～９９．４％和９２．０％～９９．４％，而与ＴＧＥＶ和ＦＩＰＶ的同源性为９０．２％和８８．０％～９０．０％；Ａｂ抗原亚位点与ＣＣＶ相同，不同于ＴＧＥＶ和ＦＩＰＶ，进一步证明本研究分离的病毒为ＣＣＶ；（２）ＣＣＶＹＳ１、ＣＣＶＣＩ１株与Ｋ３７８等ＣＣＶ强毒株同源?

联合PCR诊断大熊猫犬瘟热和犬冠状病毒的混合感染

采用一步法提取大熊猫肝脏细胞总RNA,经反转录,选择CDV和CCV联合PCR引物,一次性扩增出CDV和CCV目的片段,进一步证明了大熊猫同时感染了CDV和CCV。

犬冠状病毒核衣壳蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

以犬冠状病毒(CCV)TN449株为对象,对CCV核衣壳蛋白(N蛋白)编码基因进行克隆和原核表达,通过使用纯化的重组N蛋白,建立了CCV抗体间接ELISA检测方法。结果显示,重组N蛋白具有良好的CCV抗原反应性;经优化ELISA反应条件,确定重组N蛋白最佳包被浓度为1.0μg/m L、待检血清的最佳浓度为1∶100、阴阳性判定临界值为0.418;通过对比检测犬瘟热等多种犬病阳性血清,未发生交叉反应,证实该间接ELISA方法特异性好;用建立的间接ELISA方法对本室保存的50份CCV阳性血清和阴性血清进行复检,证实其符合率为100%。

ELISA法检测犬腹泻粪样中的犬冠状病毒

用ＦＥ细胞增殖犬冠状病毒（ＣＣＶ）参考株，分别免疫家兔和ＢＡＬＢ／ｃ小鼠制备ＣＣＶ多抗和单抗，建立了夹心ＥＬＩＳＡ及Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ诊断方法。在检测的８４例犬腹泻粪样中，多抗、单抗夹心法显示ＣＣＶ阳性１６例，Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ阳性１３例，后１３例包括在前１６例中。从８４例腹泻犬粪样中随机取３８例作ＣＣＶ、犬细小病毒（ＣＰＶ）双项检测，ＣＣＶ阳性１６例，ＣＰＶ阳性６例，ＣＣＶ、ＣＰＶ混合感染４例。结果显示，在南京地区流行的犬腹泻中，ＣＣＶ感染比例有超过ＣＰＶ的趋势。

犬细小病毒和犬冠状病毒双重PCR方法的建立及应用

根据GenBank中犬细小病毒(CPV)和犬冠状病毒(CCV)基因序列各设计了一对引物,经试验条件的优化,建立了检测CPV的PCR方法和CCV的RT-PCR方法,扩增目的片段大小分别为337bp和852bp。在此基础上建立了检测CPV和CCV双重PCR方法。该双重PCR方法能特异的扩增CPV和CCV,且分别扩增出1.08ng和3.2ng总核酸量。通过检测96份临床样品,对双重PCR方法和胶体金试纸条方法进行了对比试验。结果表明,建立的双重PCR方法快速、敏感、特异性高,可以用于CPV和CCV鉴别检测。

一例泰迪犬冠状病毒感染伴发急性肺水肿的病理诊断报告

某宠物主人送检1只4月龄泰迪犬,初步确诊为冠状病毒感染,于输液过程中突然死亡。剖检可见整个肺脏呈深红色,肺叶边缘呈粉红色,切面深红色,支气管断端有大量红色液体渗出;剖开气管可见其浆膜面呈暗红色,腔内充满红色清亮液体;心脏左右心室扩张,质地柔软,心尖钝圆,呈心力衰竭心。对各个脏器取材进行病理组织学观察,主要病变表现为肺脏弥漫性淤血、水肿,心肌纤维局部溶解坏死。诊断该犬因感染冠状病毒后初次洗澡应激加重病情,并且随着大量静脉输液导致或加剧急性肺水肿发生,最终造成该犬急性死亡。对该病例进行了系统地病理剖检和组织病理学观察,为犬科动物和其他动物发生类似病症提供一定的参考。