基于pgk蛋白的犬嗜血支原体ELISA诊断方法的建立

为了开发一种准确、快速的检测犬嗜血支原体的方法,建立了一种基于犬嗜血支原体磷酸甘油酸激酶(PGK)的间接ELISA方法.从已发表的NCBI犬嗜血支原体全基因组序列库中获得了其磷酸甘油酸激酶(PGK)基因序列.通过选择原核生物首选的密码子优化基因序列,将化学合成的新基因序列pgk插入质粒中,成功构建了原核表达载体pet32a(+)-pgk,并在大肠杆菌BL21中表达.经SDS-PAGE证实,该蛋白的相对分子量约为60 ku.以纯化的PGK重组蛋白作为抗原进行包被,建立了基于PGK蛋白的间接ELISA方法,并进一步对条件进行优化.结果表明,抗原的最佳包被浓度为2.5μg/mL,血清的最佳稀释倍数为1∶200,封闭剂的最佳工作浓度为5%脱脂乳,最佳封闭时间为45 min,待检血清的最佳作用时间为60 min,酶标二抗的最佳工作浓度为1∶5000,酶标二抗的最佳作用时间为30 min.基于以上,建立了一种检测犬嗜血支原体的间接ELISA方法,并选择临床阴性血清计算其临界值.采用该方法检测166份临床样本,阳性率为21.1%,与荧光定量PCR检测结果一致.本研究为犬嗜血支原体的临床监测提供了一种有效的检测方法,并为进一步预防和治疗该病提供了研究依据.