犬圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

犬圆环病毒(DogCV)是圆环病毒科新发现的圆环病毒,旨在建立犬圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法。试验用PCR方法克隆犬圆环病毒ORF2基因保守区域,构建标准阳性质粒pClon007-ORF2。以标准阳性质粒pClon007-ORF2为模板对荧光定量PCR反应体系进行优化。结果表明,所建立的方法 Ct值与标准品在4.67×10~9 copies/μL^4.67×10~3 copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.998,斜率为-3.445。该方法检测灵敏度为4.67×10~1copies/μL。该方法对狂犬病病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒2型等犬常见病原的检测均无交叉反应;所有稀释度标准品模板均在83.35℃出现窄的特异性熔解峰。临床样品检测表明,所建立的实时荧光定量PCR对犬圆环病毒的阳性检测率为12.50%(4/32)。

猪圆环病毒2型感染对伪狂犬疫苗免疫应答的影响

为明确PCV2感染对伪狂犬(PR)疫苗免疫应答的影响,本研究采用阻断ELISA方法对单独接种猪PR疫苗组(A组)及PCV2人工感染3周后接种猪PR疫苗组(PA组)不同时相血清中的猪PR病毒gB抗体进行检测;同时对不同时相前腔静脉血进行CD4+/CD8+流式细胞术及血常规分析。结果表明,在PCV2感染后2周至5周间,A组白细胞含量均高于PA组,随后PA组白细胞恢复至与A组略高的正常水平;在整个实验中,除接种猪PR疫苗后1周(WPI)和9周(WPI)外的所有时相PA组的淋巴细胞含量均略高于A组;PCV2感染后可使记忆/激活Th细胞数量略有升高,幼稚型Th细胞含量的下降;PCV2感染后2周～7周PA组Tc细胞均高于A组,在9WPIPA组Tc细胞数量显著下降(p<0.05);除9WPI外,A组的S/N值均低于PA组。结果表明,PCV2感染看降低机体产生针对PRVgB特异性抗体水平,而且在一定程度上降低了幼稚型Th细胞及Tc细胞含量。

犬圆环病毒Cap蛋白的生物信息学分析及原核表达

犬圆环病毒(CanineCV)是近年被发现的圆环病毒属新成员,获取CaineCV Cap蛋白,为研究Cap蛋白的功能以及抗原表位奠定了基础。本研究以CaineCV GX2017株基因组作为模板,使用PCR方法扩增出Cap蛋白的基因序列,对其进行生物信息学分析,并克隆至pET-28a原,进行原核表达。结果表明:GX2017的N端2~26位氨基酸存在一个核定位信号,同时含有3个B细胞表位(aa7~aa14;aa150~aa174;aa233~aa253);第134位氨基酸为N-糖基化位点,第169和第238位氨基酸为O-型糖基化位点;进化分析表明,本研究的CanineCV Cap蛋白基因序列与欧美株同源性较低,且处在不同的分支;SDS-PAGE结果显示,重组Cap蛋白在E.coli BL21(DE3)中不能正确表达,切除了NLS的d(1-26)Cap蛋白能在E.coli BL21(DE3)中大量表达;Western blot 分析表明,该重组蛋白能与Anti-His 标签抗体发生特异性反应。本研究成功构建了pET-d(1-26)Cap重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中获得高水平表达,为进一步制备Cap蛋白的抗体奠定了基础。

犬圆环病毒病研究进展

自2012年美国首次报道犬圆环病毒(CanineCV)以来,随后欧洲、北美洲及亚洲等地区陆续从腹泻犬中发现该病毒。犬圆环病毒可感染不同年龄段犬,尤其以幼龄犬感染率较高。该病毒可以感染狼和獾等食肉动物,经常与犬细小病毒发生混合感染,造成犬的出血性腹泻。犬圆环病毒(CanineCV)与其他肠道病毒协同作用,加重胃肠道疾病。然而对于犬圆环病毒病的研究还没有完全深入,论文就目前已知犬圆环病毒病的病原特征与致病性、流行病学、诊断等方面的研究进展进行概述,为犬圆环病毒的研究提供参考。

猪圆环病毒、猪伪狂犬及仔猪副伤寒混合感染的病例分析

2015年9月中旬,河南省驻马店市上蔡县某400头母猪场,体重在35~45 kg阶段猪群发生顽固性拉稀、粪便潜血或鲜红。据畜主描述,该场有一栋存栏200多头该阶段猪只,已发病近半个月,发病率在40%,病程持续一周左右即可死亡。发病期间,该场使用过痢菌净、阿莫西林和柴胡注射液,但效果不佳。

一例猪伪狂犬、圆环病毒与副猪嗜血杆菌病混合感染的诊治分析

2018年3月份驻马店市某猪场保育猪发生了伪狂犬、圆环病毒与副猪嗜血杆菌混合感染的疫情,呼吸道症状明显,个别猪出现腹泻、腿瘸现象。现将整个诊治情况介绍如下。发病猪群为4~8周龄的保育猪,于3月11日出现发病症状,至3月20日有症状的病猪有20多头,已死亡6头。病程一般6~8d,日龄越小的猪发病越严重,死亡率越高。病猪发烧,体温40℃左右,精神萎靡,嗜睡,采食下降或废绝;腹泻,排黄色稀粪;呼吸困难,咳嗽、甚至喘息;身体背部、耳朵有出血点;个别猪关节肿大,腿瘸;部分猪出现肌肉震颤、口吐白沫、四肢游泳等神经症状。

犬圆环病毒荧光RAA检测方法的建立及初步应用

为建立一种高效、简便的犬圆环病毒(CCV)的检测方法,本研究针对CCV Rep基因设计了特异性引物和探针,同时构建了基于该病毒Rep基因的重组质粒标准品pCCV-Rep,经过优化后确定了CCV重组酶介导核酸等温扩增(RAA)检测方法引物、探针的最适浓度均为10μmol/L,在39℃恒温条件下20 min即可完成检测。利用该方法检测犬圆环病毒、狂犬病病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒等其他常见的犬源病毒,结果显示除CCV外,该方法对其他病毒均无交叉反应,特异性较强;将p CCV-Rep分别稀释为10~6拷贝/μL~10~0拷贝/μL后作为模板,进行敏感性试验,结果显示该方法最低检出限可达10~2拷贝/μL,敏感性较高;批内批间重复性试验结果均表明该方法具有良好的重复性。采用该方法与常规PCR方法同时检测82份犬粪便拭子,结果显示,该RAA方法检出阳性样品5份,检测结果与常规PCR一致。本实验首次建立的CCV荧光RAA检测方法简便、高效、特异、灵敏,为CCV的临床筛查与流行病学研究提供了可行技术。

重庆地区犬圆环病毒检测及序列分析

本试验旨在调查近年来新发的犬圆环病毒(canine circovirus,CCV)在重庆地区的流行情况,探索重庆流行毒株的特性。本研究利用PCR方法对2017年采集于重庆地区的100份犬血清样品进行CCV核酸检测,对所得CCV阳性样品进行全基因组扩增与测序,并利用MegAlign、Mega 6.0和RDP4等软件对分离到的重庆CCV毒株进行分析。结果显示,重庆地区100份犬血清中共有4份为CCV阳性,阳性率为4%,从4份阳性样品中共获得3株不同的CCV基因组(CQ76、CQ79和CQ82),全长基因组序列均为2062 nt,与此前报道长度为2063 nt的CCV基因组相比缺少了一个碱基,该碱基位于5′-基因间隔区内茎环结构的下游。3个毒株的两个ORF之间5′末端间隔区和3′末端间隔区长度分别为134(1929-2062 nt)和203 nt(913-1115 nt)。CQ76、CQ79和CQ82的同源性在99.8%~100%之间,其中CQ76与CQ82仅在第2019位点存在同义突变;所获得的3个重庆毒株与国内外报道的其他CCV基因组序列同源性为82.7%~97.1%,其中,ORF2的变异程度大于ORF1。基于病毒ORF2序列和全基因组分别构建NJ进化树中,CQ76、CQ79和CQ82均属于同一亚群,与属于基因Ⅱ型的中国毒株204株遗传距离较近,同源性为96.5%~96.7%。RDP4重组分析发现,CQ76、CQ79和CQ82毒株基因组均为广西毒株204株和388株的重组序列,重组区域坐落于ORF2。本研究为丰富CCV流行病学和遗传进化信息,以及进一步防控研究提供基础数据。

四川部分地区犬圆环病毒的病原检测及基因组特征

为调查犬圆环病毒(CanineCV)在四川部分地区的流行情况及基因组特征,本研究采用荧光定量PCR方法检测了2015年～2017年采集自四川6家宠物医院的208份腹泻犬粪便样品。结果显示CanineCV的平均阳性率为15.4%(32/208),3年间的检出率无明显变化;并且阳性样品均与一种或多种病原共感染。获得了6条完整的CanineCV Rep基因序列及1株CanineCV (CD17/2016)全基因组序列,进化分析显示CanineCV四川株(CD17/2016)与GenBank中的国内另外2株CanineCV遗传距离较远。本研究首次对国内腹泻犬进行了CanineCV感染的调查,证明CanineCV在四川部分地区宠物犬中已流行,建议把CanineCV作为犬腹泻病原诊断的一个检测内容,同时对其分子特征的研究结果将有助于进一步了解国内CanineCV的遗传多样性。

犬圆环病毒Rep蛋白的原核表达

犬圆环病毒(CanineCV)是一种新发现的圆环病毒。制备针对CaineCV Rep的抗体,为建立CaineCV ELISA检测方法及研究Rep蛋白的功能奠定基础。以CaineCV基因组作为模板,扩增出Rep基因序列。PCR产物克隆至pET-28a原核表达载体上,获得了重组质粒pET(28a)-Rep。将重组质粒转入大肠埃希菌BL21感受态细胞后进行诱导表达,SDS-PAGE分析表明重组Rep蛋白在大肠埃希菌BL21中获得表达。Western blot分析表明,重组蛋白能与Anti-His标签抗体发生特异性反应。该研究构建了pET(28a)-Rep重组原核表达质粒,并在大肠埃希菌中获得表达,为进一步制备Rep的抗体奠定了基础。

犬源牛犬细小病毒和犬圆环病毒二联PCR检测方法的建立及应用

本研究旨在建立可同时检测犬源牛犬细小病毒(CBoV)和犬圆环病毒(CCV)的二联PCR检测方法,并对两种病毒病当前的流行情况进行监测和调查。分别将已发表的CBoV和CCV基因组序列进行同源性比对,选择高同源区段,应用Primer Primier 5计算机软件设计并合成了2对特异性扩增引物,目的片段大小分别为170 bp(CBoV)和239 bp(CCV)。分别提取CBoV和CCV重组质粒作为模板,进行二联PCR扩增试验。结果表明,本研究成功建立了可同时检测CBoV和CCV的二联PCR检测方法。并对其重复性、特异性和灵敏度进行验证,二联PCR最低检测限度为3.0 pg总DNA,而对犬细小病毒2型、犬瘟热病毒和犬副流感病毒的PCR检测结果均为阴性。对送检的30份病料进行检测,其中,4份为CBoV阳性,3份为CCV阳性,未检测到混合感染。综上所述,本研究所建立的CBoV和CCV二联PCR诊断方法特异性高,敏感性好,可用于临床犬腹泻病的流行病学调查。

犬圆环病毒检测和致病性的研究进展

犬圆环病毒(Canine circovirus,Canine CV)是2012年首次在美国报道的一种新型哺乳动物圆环病毒。之后,意大利、德国和中国陆续报道检测到该病毒。目前已证实Canine CV可引起犬发生坏死性血管炎和淋巴结肉芽肿,临床表现为出血性腹泻和呕吐等,但该病毒的致病机理尚不清楚。文中主要对Canine CV的检测和致病性研究进展进行综述,为Canine CV的流行病学调查和致病机理研究等提供参考。

一例犬细小病毒与圆环病毒混合感染的诊断报告

本试验的目的是对1例以呕吐和血便为突出症状的6月龄博美犬进行病原检测。采用PCR方法检测了犬细小病毒、犬冠状病毒、犬瘟热病毒、犬圆环病毒和犬星状病毒五种致犬腹泻的病毒,结果显示为犬细小病毒和犬圆环病毒的混合感染。本试验为犬病毒性腹泻的病原诊断提供了参考。

猪圆环病毒3型病毒在犬类的检测试验研究

为了检测PCV3是否存在于猪以外的其他动物体内,该研究对湖南省长沙兽医院收集的44份犬血清进行了PCV3检测,并对阳性PCV3全基因进行克隆测序和序列分析。结果表明:犬中存在PCV3,且与FCV(KP941114)和CCV(JQ821392)进化关系密切,与参照株PCV3(KX966193、KY075987、KY075991、KX898030、KX77872)核苷酸同源性最高为96.28%~98.91%,与PCV1(AF071879)和PCV2(AY424405、AY322004、KP112486和EU148504)同源性较低为24.8%~27.4%。

一起猪伪狂犬、圆环病毒及大肠杆菌混合感染的诊治

贵州某县养猪场发生了以母猪流产、仔猪腹泻、神经症状为特征的疾病。通过运用不同病原的特异引物,对采集的病料进行PCR和RT-PCR检测,结果发现伪狂犬病毒、圆环病毒为阳性,结合临床症状、剖检变化、细菌分离培养、生化实验等实验室检查,诊断为伪狂犬、圆环病毒及大肠杆菌混合感染,经过综合性治疗,取得了较好的效果。

猪圆环病毒、猪伪狂犬及仔猪副伤寒混合感染的病例探析

目的:探讨对猪圆环病毒、猪伪狂犬及仔猪副伤寒混合感染的诊断与治疗方法及效果.方法:对本市某地区的养猪场内出现的猪圆环病毒、猪伪狂犬及仔猪副伤寒混合感染的情况进行了回顾性分析.结果:通过对症治疗和综合性治疗,全猪场内除治疗前死亡的猪只外,剩下的发病猪只均未出现死亡现象,且病情均得到了有效控制.结论:通过实施病理解剖及实验室确诊,明确猪只的疾病类型,并对其实施针对性的治疗措施,能够有效控制猪圆环病毒、猪伪狂犬及仔猪副伤寒混合感染.

猪伪狂犬病病毒和猪副猪嗜血杆菌混合感染的诊断与防制

1发病情况 2014年6月16日新疆奎屯市某猪场从石河子垦区某团猪场购进断奶仔猪180头,饲喂浓缩料,并在饲料中加入泔水,该猪群曾经做过猪瘟、圆环病毒灭活苗、链球菌蜂胶灭活苗和猪繁殖与呼吸综合征活疫苗免疫,发病之前生长良好。

犬圆环病毒全基因组克隆与序列分析

犬圆环病毒(Dog circovirus,DogCV)是近年来新发现的一种哺乳动物圆环病毒。为研究DogCV中国流行毒株基因组特性和遗传进化,以犬血清样品提取的DNA为模板,采用重叠PCR技术首次获得DogCV中国流行毒株的全基因组序列,命名为JZ98/2014。序列分析表明JZ98/2014全基因组长度为2063nt,编码3个主要开放阅读框:ORF V1(Rep蛋白,303个氨基酸)、ORF C1(Cap蛋白,270个氨基酸)和ORF C2(106个氨基酸)。同源性比较显示JZ98/2014与美国、欧洲流行毒株的全基因组序列同源性为82.1%-89.5%,而Rep和Cap基因同源性分别为82.1%-89.5%和84.6%-89.1%。遗传进化树分析显示,目前世界流行的DogCV存在多个分支,而JZ98/2014与美国、欧洲流行毒株处于不同分支。