某犬场犬型钩端螺旋体的分离与鉴定

目的:对疑为钩端螺旋体病的军犬病科进行致病性钩端螺旋体分离和鉴定,为钩端螺旋体病的诊断提供理论依据。方法:对病犬进行解剖观察,用犬尿液接种柯索夫培养基进行钩体的分离,然后对分离到的钩体进行菌型鉴定并用钩体外膜蛋白基因引物进行PCR检测。结果:从尿液中分离到1株钩体,经鉴定为犬群犬型,PCR扩增结果为阳性。结论:从病犬中分离到1株犬型致病钩体。

犬型钩端螺旋体抗血清被动免疫保护力初步测试

目的 :拟通过大型钩端螺旋体 5 6 6 0 3株 39KD抗原抗血清的制备及其抗血清免疫保护力测试 ,为钩体病的诊断与防治研究提供资料。方法 :将 39KD抗原采用四种方法接种家兔制备抗血清 ,然后通过被动免疫途径 ,对其抗血清免疫保护力进行测试。结果 :四种方法接种家兔制备的抗血清凝集效价均在 2 0 0左右 ,四者无显著差异。除 1株非致病钩体PatocⅠ外 ,其抗血清能保护豚鼠免受 10株致病性钩体 ( 10群 10型 )的攻击。结论 :犬型钩体 39KD抗原抗血清 ,具有很好的动物免疫保护作用 ,具有种特异性 ,值得进行深入的研究。

犬型钩端螺旋体外膜蛋白OmpL1基因的克隆与序列分析

作者以犬型钩端螺旋体菌株的DNA为模板,采用PCR方法扩增目的基因OmpL1,克隆到pVAX1载体上,并对OmpL1基因测序后进行序列分析。结果获得960bp片段,DNA序列分析结果表明,该菌株的OmpL1基因与报道的七日热型、秋季型、波摩那型、澳洲型钩体的OmpL1基因核苷酸序列相似性分别为99.38%、93.77%、99.58%、99.38%,氨基酸序列相似性分别为100%、95%、100%、100%。证明OmpL1为致病性钩体所具有的保守性抗原成分,可在钩体病的预防和诊断中发挥重要作用。

犬瘟热病毒和犬腺病毒2型双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

旨在建立犬瘟热病毒(CDV)和犬腺病毒2型(CAdV-2)双重TaqMan荧光定量PCR(RT-qPCR)检测方法。本试验针对CDV的N基因和CAdV-2的E3基因设计两对特异性引物与两条标记不同荧光基团的TaqMan-MGB探针,对引物、探针的浓度、反应体系和反应条件进行优化后检测该方法的灵敏度,特异性及重复性。结果:该方法在CDV和CAdV-2阳性参考质粒浓度1×10^(1)~1×10^(7) copies/μL的范围中,R2值为0.997和0.993,表明所建的标准曲线具有良好线性关系,能检测到最低浓度为5 copies/μL,并对其他病原无扩增现象,特异性良好;重复性试验中组内和组间变异系数小于1.54%。综上,建立的双重TaqMan RT-qPCR检测方法具有灵敏度高且特异性好等优点,可用于CDV和CAdV-2临床快速检测和鉴别诊断及流行病学调查等领域。

犬腺病毒2型的分离鉴定和致病性分析

为了解湖北省犬腺病毒2型(CAV-2)的基因遗传变异特征,本试验从武汉市某比格犬养殖场采集免疫过犬四联活疫苗的临床发病犬的眼、鼻和肛拭子,将经PCR检测为CAV-2阳性的病料接种犬肾细胞(MDCK细胞)进行病毒分离,对CAV-2分离株进行电子显微镜观察和间接免疫荧光鉴定,E3、Fiber、Penton和E1b基因PCR扩增和测序分析以及致病性试验。结果显示:经分离和鉴定共获得3株CAV-2,分别命名为HB404株、HB405株和HB078株。3株CAV-2分离株的E3、Fiber、Penton和E1b基因与国外疫苗毒株相似性分别为98.4%~99.6%、99.3%~99.9%、99.8%~99.9%和99.5%~99.7%;3株分离株的E3、Fiber和Penton基因与国内流行毒株相似性分别为96.6%~97.5%、98.5%~99.7%和99.4%~99.9%。且3株CAV-2分离株与国外疫苗毒株在同一分支,与国内流行毒株不在同一分支。HB405株能使犬出现精神不振、食欲减退、眼鼻有分泌物、打喷嚏和咳嗽等临床症状。结果表明,3株分离株的亲缘关系与国外疫苗毒株较近,HB405株为强毒株,能够使犬发病。本试验结果可为CAV-2的诊断和预防提供参考依据。

犬1型腺病毒诊断方法研究进展

犬1型腺病毒(Canine adenovirus 1,CAdV-1)是一种主要感染犬科动物,并可引起传染性肝炎的重要病原,CAdV-1的诊断研究一直是兽医学领域的研究热点。目前已经有多种方法用于检测CAdV-1,包括病毒分离鉴定、血清学和PCR检测等。其中,PCR检测具有较高的灵敏度和特异性,已成为最常用的检测方法之一。因此,通过血清学、病原学和分子生物学三方面综述CAdV-1诊断方法的研究进展,为开发CAdV-1防控新产品提供参考。

N-乙酰-L-半胱氨酸抗1型糖尿病模型比格犬晶状体上皮氧化损伤的作用

本研究旨在探讨N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)对1型糖尿病模型比格犬晶状体上皮氧化损伤的影响。将40只2~3岁比格犬随机分为对照组(CON组)、糖尿病模型组(DM组)、胰岛素治疗组(INS组)、NAC联合胰岛素治疗组(NAC+INS组)和NAC治疗组(NAC组),每组8只,各治疗组试验犬模型建立持续120 d。在造模前及造模后按试验设定时间对犬进行空腹血糖监测、胰岛素释放试验、房水葡萄糖测定、用裂隙灯进行白内障等级评定。对眼晶状体上皮进行病理组织学观察的同时,利用ELISA、RT-PCR等方法对晶状体内氧化应激指标进行检测。试验结果显示:空腹血糖监测和胰岛素释放试验显示,成功建立了1型糖尿病比格犬模型;与CON组相比,DM组犬在试验结束时,血清及房水葡萄糖显著升高(P<0.05),晶状体功能明显下降;裂隙灯结果显示,DM组犬的晶状体混浊等级在试验结束时达Ⅳ级,其余4组并未出现明显皮质混浊迹象,且DM组的晶状体上皮出现细胞核固缩和坏死小体等较为明显的病理变化;NAC、INS和NAC+INS组血糖虽呈下降趋势,但仍高于CON组,其中,NAC+INS组血糖较DM组显著下降(P<0.05),晶状体混浊也明显改善;试验结束时,与CON组相比,DM组犬晶体上皮和房水MDA含量升高(P<0.05或P<0.01),GSH-Px活性和GSH/GSSG均显著下降(P<0.05或P<0.01),GR活性下降(晶状体上皮,P>0.05;房水,P<0.01),给予NAC联合胰岛素治疗后,晶体上皮内的氧化应激标志物均出现相反趋势;DM组及各治疗组中抗氧化相关基因SOD2和GR表达量均显著升高(P<0.05)。综上:NAC联合胰岛素治疗能有效改善糖尿病犬的血糖和晶状体功能,NAC联合胰岛素治疗后对糖尿病犬晶状体上皮损伤的保护作用可能和抑制晶状体的氧化应激有关。

犬腺病毒2型E3基因自然缺失毒株的分离鉴定及其致病性

犬腺病毒2型(canine adenovirus type 2,CAV-2)是重要的犬呼吸道病原,本试验旨在调查CAV-2在川渝部分地区的流行情况及其分离毒株致病性。采用检测CAV-2的特异性PCR方法,对2021—2022年采集自川渝部分地区的121份患呼吸道疾病的犬鼻咽拭子进行检测,分离流行毒株并研究其基因组特征及致病性。结果显示:CAV-2的阳性率为29.8%,值得注意的是,69.4%的阳性样本在E3基因存在9个核苷酸连续缺失(1035—1043 nt),导致4个氨基酸缺失(345—348 aa)。成功分离出1株E3基因自然缺失毒株,噬斑纯化后的细胞半数感染值为10-9.46TCID50·0.1 mL^(-1);该毒株经口鼻感染幼犬后,幼犬出现体温升高、打喷嚏、流鼻涕及咳嗽等典型呼吸道症状。该分离毒株基因组全长31786 bp,与GenBank中CAV-2基因组的核苷酸相似性为98.8%~98.9%。与已知的CAV-2基因组相比,本研究分离毒株除了E3基因的独特突变外,还在Fiber、Hexon和E1A等蛋白有独特的氨基酸突变,使得该毒株在基因组进化树上区别于已知的CAV-2毒株。本试验首次获得了中国CAV-2毒株的基因组序列,发现了E3基因的自然缺失现象,有助于了解CAV-2的流行及遗传进化。

犬急性水肿型胰腺炎MRI多序列扫描及增强扫描的影像特征

探究犬胰腺磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)扫描序列总结归纳犬急性水肿型胰腺炎(acute edematous pancreatitis,AEP)的MRI影像表现。选用10只成年本地杂种犬为研究对象,手术经副胰管逆行注入牛磺胆酸钠与胰蛋白酶混合液建立犬急性水肿型胰腺炎模型,然后进行MRI扫描。MRI多序列扫描图像主观与客观分析结果显示,门控采集快速自旋回波T2加权成像(FSE-T2WI-TRIG)序列与门控采集脂肪抑制快速自旋回波T2加权成像(FSE-T2WI-FS-TRIG)序列评分较高,可作为犬胰腺首选MRI扫描序列,必要时可进行造影增强扫描。FSE-T2WI-TRIG、FSE-T2WI-FS-TRIG序列AEP表现为胰腺体积呈弥散性增大,外形不规则,胰腺实质T2WI信号呈不均匀增高,强度高于同层肝组织信号。胰腺与周围脂肪界限稍有不清,胰腺周围伴有渗出,呈条片状T2WI高信号。造影后胰腺实质不均匀强化,平均强化峰值时间为注射造影剂后60~90 s,存在明显延迟强化。研究结果表明,本研究筛选的MRI扫描序列可用于临床上犬AEP的检查,同时AEP的MRI影像表现可为临床上犬AEP的诊断提供重要的依据。

一例犬冠状病毒Ⅰ型与犬腺病毒Ⅱ型混合感染的实验室诊断

本试验对1例2月龄中华田园犬进行病原诊断,该病犬主要症状为腹泻、血便并伴随流涕、打喷嚏、咳嗽等。采集其鼻拭子、肛门拭子,利用PCR方法分别对7种常见的犬腹泻病毒及呼吸道病毒进行检测,结果显示该病例为犬冠状病毒Ⅰ型与犬腺病毒Ⅱ型的混合感染。待病犬进入濒死期立即安乐死并进行剖检,组织观察可见肺部出现明显的出血斑,盲肠、直肠、结肠有明显的出血点。本试验为犬病毒性腹泻、呼吸道疾病的病毒诊断以及犬冠状病毒Ⅰ型、犬腺病毒Ⅱ型自然感染引起的组织病变提供了参考。

犬2型腺病毒的分离鉴定

研究旨在通过对采集自辽宁省辽阳某犬专业合作社犬传染性肝炎患犬病料进行分离和鉴定,了解犬腺病毒(CAV)的生物学特性。试验通过分子生物学鉴定、病毒分离、抗性测定、电镜观察、病毒特异性鉴定和动物回归试验等对分离毒株的生物学特性及致病力进行研究。结果显示,通过PCR扩增可得到1019 bp的特异性的核酸片段,命名为CAV A22株。通过核苷酸序列分析,分离株与GenBank上登录的国内外已发表CAV参考序列的核苷酸序列同源性最高达100%。由遗传进化树可知,分离株与U77082亲缘关系较近,处于同一分支;该分离株可在MDCK细胞上连续传代,病毒含量可达105.5TCID50/0.1 mL以上;电镜观察可见圆形、无囊膜、直径约80 nm的典型病毒粒子。病毒特异性鉴定表明分离株为犬2型腺病毒(CAV-2)。病毒回归试验表明,分离株致病力较弱,加以驯化可成为一株良好的疫苗毒株。

活血降糖方对1例犬Ⅱ型糖尿病的治疗

采用活血降糖方对犬Ⅱ型糖尿病进行治疗,将中医方剂应用到宠物临床。以沈阳某动物医院患有Ⅱ型糖尿病的患犬为例,通过灌服活血降糖方汤剂(20 mL/kg),于治疗前1 d、治疗后第1、7、14天监测各组犬只的临床症状及生化检测。结果表明,活血降糖方在降低血糖、维持机体各项指标稳定方面相对突出,且没有耐药性。活血降糖方治疗犬Ⅱ型糖尿病,对患犬的身体情况有较好的调理作用,为中医治疗宠物糖尿病提供了新的诊疗思路。

表达犬瘟热病毒H基因的重组犬2型腺病毒的构建与鉴定

将犬瘟热病毒 ( canine distemper virus,CDV ) H基因表达盒克隆入转移质粒 p VAXΔE3,构建含 CDV H基因表达盒的转移质粒 p VAXΔ E3L PH,用 Nru 和 Sal 分别酶切转移质粒 p VAXΔ E3L PH和犬 2型腺病毒全基因组质粒p Poly2 - CAV- 2 ,将 CDV H基因表达盒定向克隆入 p Poly2 - CAV- 2质粒中 ,构建 E3区部分缺失的包含 CDV H基因表达盒的犬 2型腺病毒重组质粒 p CAV- 2 / CDVL PH。 Asc 和 Cla 对 p CAV- 2 / CDVL PH进行双酶切 ,释放 CAV- 2 /CDVL PH重组基因组 ,利用脂质体将 CAV- 2 / CDVL PH重组基因组与去除 Sal 和 Nru 片段的 CAV- 2基因组两端片段共转染 DK细胞 ,盲传和重复转染 3次 ,4 d后出现典型 CAV- 2病变 ,获得重组病毒 CAV- 2 / CDVL PH。用 CDV H基因特异性引物经 RT- PCR扩增重组病毒 DK细胞培养物 ,能够扩增出相应的核酸片段 ,表明 CAV- 2 / CDVL PH在DK细胞繁殖的过程中能够转录 CDVL P H的 m RNA,重组病毒免疫犬 ,可以诱导犬产生特异的抗 CAV- 2 HI抗体和抗

表达狂犬病毒糖蛋白抗原的重组犬2型腺病毒的构建及鉴定

为研制一种预防犬科动物狂犬病的新型疫苗,将含有狂犬病毒ERA株糖蛋白基因(Rabies glycoprotein,Rgp)表达盒的穿梭质粒pVAXΔE3Rgp中的Rgp表达盒克隆入犬2型腺病毒(Canine adenovirus type2,CAV2)骨架质粒pPoly2-CAV2中,获得重组质粒pPoly2-CAV2-ΔE3-Rgp,释放其基因组,转染MDCK细胞系,获得E3缺失区(Deletion of early protein3,ΔE3)含有Rgp表达盒的重组病毒CAV2-ΔE3-Rgp。该重组病毒能在MDCK细胞上产生典型的腺病毒细胞病变。通过酶切、PCR、基因测序,表明该重组病毒含有完整的Rgp表达盒。通过RT-PCR、Western blot等检测,表明该重组病毒能够表达Rgp抗原。用该重组病毒免疫犬,3次免疫后,可以诱导犬产生特异的抗CAV2HI抗体,其效价超过1∶256和抗狂犬病病毒(Rabies virus,RV)中和抗体,其效价超过0.50IU/mL。试验结果表明,获得的重组病毒免疫犬后,能够产生抗狂犬病毒和腺病毒的高效价保护性抗体,是一种有潜力的犬科动物狂犬病毒腺病毒二联疫苗候选株。

感染性犬2型腺病毒全基因组克隆及鉴定

以犬 2型腺病毒 (canine adenovirus type- 2 ,CAV- 2 )自然弱毒株 YCA18基因组 DNA为模板 ,经 PCR扩增分别获得其双链两末端 10 13bp(U)和 972 bp(D)的 DNA序列 ,以首尾相接方式克隆入载体 p Poly2 ,获得重组质粒p Poly2 - UD。以 Hind 和 Bst B 双酶切 p Poly2 - UD,回收含载体和部分 U、D的大片段并与 CAV- 2 DNA共转化感受态 E.coli Sure TM,经菌体内同源重组 ,获得含有 CAV- 2全基因组序列的重组质粒 p Poly2 - CAV- 2。后者以 Cla 和 Asc 双酶切 ,释放 CAV- 2全基因组 ,通过脂质体介导转染 MDCK细胞 ,盲传 3代后重复转染 1次 ,4d后 ,出现腺病毒典型病变。细胞上清血凝效价为 1∶ 6 40 ,并可被 CAV- 2抗血清有效抑制。以上结果表明 ,本研究获得了具有感染性的CAV- 2全基因组重组质粒 ,为以 CAV- 2作为重组疫苗载体的系列研究奠定了重要基础。

犬2型腺病毒通用载体的构建及鉴定

为了获得能够携带较大外源基因的犬2型腺病毒E3区缺失性载体,以犬2型腺病毒全基因组质粒pPolyⅡ-CAV-2及E3区重组质粒pVAX-E3为基础,缺失1381bp的E3区片段(92.6%的E3区全序列),插入Linker-NF(内含NotⅠ、ClaⅠ、FseⅠ多克隆位点),获得重组载体质粒pPolyⅡ-CAV-2-ΔE3(NF)(31.9kb)。以AscⅠ和PmeⅠ双酶切,游离重组基因组,在脂质体LipofectamineTM2000介导下,转染MDCK细胞系,获得了E3区缺失的重组病毒CAV-2-ΔE3(NF)。通过病毒的形态学观察,血凝性、生长特性、感染性实验证明,该重组病毒与母源病毒没有差异。重组病毒CAV-2-ΔE3(NF)可以作为载体表达外源基因,其外源基因插入片段不小于3.3kb。

犬Ⅰ型腺病毒TN株的分离鉴定

应用 MDCK细胞采用单层吸附接毒和带毒传代的方法 ,从新疆阿克苏送检的犬粪便中分离出 1株犬腺病毒 ,并对其进行了形态学、理化学、血清学、动物感染试验、分子生物学鉴定。结果证明所分离的 TN株为 1株CAV-

狂犬病病毒核蛋白基因重组犬2型腺病毒的构建研究

目的获得具有感染性的狂犬病病毒核蛋白犬2型腺病毒,并对重组病毒生物学和免疫学特性进行初步探讨。方法对克隆的犬2型腺病毒全基因组E3区进行部分缺失后,插入由CMV启动子、狂犬病病毒SRV9株核蛋白基因和牛生长激素polyA构成的长2392bp的表达盒,然后通过AscⅠ和PvuⅠ双酶切,游离重组全基因组,转染犬肾细胞系。结果盲传5代后,细胞产生典型病变。经鉴定,确定得到了狂犬病病毒核蛋白重组犬2型腺病毒(CAV2RN)。Westernblot检测表明,狂犬病病毒核蛋白在重组犬2型腺病毒中得到了表达。结论重组病毒可以诱导受试犬产生针对犬2型腺病毒和狂犬病病毒核蛋白的特异性抗体。

犬Ⅱ型腺病毒的分离鉴定

在做犬腺病毒分子流行病学调查的过程中，从送检的犬粪便中分离出多株犬腺病毒，并对其中１ 株进行了系统鉴定。经形态学、理化学、血清学交叉中和试验、动物感染试验与分子生物学鉴定，证明为１ 株犬传染性喉气管炎病毒的强毒，即犬Ⅱ型腺病毒。