蒜氨酸靶向调控表皮生长因子受体和犬尿氨酸酶治疗类风湿性关节炎的分子机制

背景:蒜氨酸作为大蒜中的主要活性成分具有抗炎和抗氧化作用,但蒜氨酸改善类风湿性关节炎的作用和机制仍不清楚。目的:利用基因表达数据分析类风湿性关节炎的差异表达基因,探讨蒜氨酸在类风湿性关节炎中的调控作用。方法:从GSE45291和GSE93777数据集中收集类风湿性关节炎的基因表达数据,进行差异表达分析。对两套数据中的共同差异表达基因进行共表达网络分析,识别与类风湿性关节炎相关性最高的模块基因,进行功能富集分析。通过SwissTargetPrediction数据库预测蒜氨酸的靶向调控基因,并与差异表达基因行交集分析,计算差异表达靶基因的受试者工作特征曲线下面积。将人永生化类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞接种于孔板内培养24 h后分5组处理:对照组不进行任何处理,阳性药组加入甲氨蝶呤,蒜氨酸低、中、高质量浓度组分别加入20,80,160μg/mL的蒜氨酸,处理48 h后,CCK-8法检测细胞活性,TUNEL法检测细胞凋亡,ELISA法检测氧化应激和炎症因子水平,JC-1法检测线粒体膜电位变化,RT-qPCR和Western Blot检测靶基因及相关信号通路的表达。结果与结论:(1)在GSE45291和GSE93777数据集中共鉴定出6 487个共同的差异表达基因,并获得了12个共表达模块,magenta模块与类风湿性关节炎的相关性最高,模块基因主要富集于磷酯酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路。(2)通过数据库预测发现7个差异表达基因被蒜氨酸靶向调控,其中表皮生长因子受体在GSE45291数据集中的受试者工作特征曲线下面积值最大,犬尿氨酸酶在GSE93777数据集中的受试者工作特征曲线下面积值最大。(3)与对照组比较,其他4组类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞活性降低,细胞凋亡数量增加,活性氧、丙二醛、白细胞介素6、白细胞介素1β水平均降低,线粒体膜电位均升高,表皮生长因子受体、犬尿氨酸酶、线粒体动力相关蛋白1mRNA与蛋白表达均降低,线粒体融合蛋白2 mRNA与蛋白表达均升高,p-AKT、p-PI3K蛋白表达均升高。(4)结果表明,蒜氨酸通过调控表皮生长因子受体和犬尿氨酸酶等靶基因发挥潜在的类风湿性关节炎治疗作用。

脑组织过表达犬尿氨酸酶的转基因小鼠对血压的影响

目的本研究旨在构建脑组织选择性过表达犬尿氨酸酶(Kynu)的转基因小鼠,在整体水平研究KYNU活性增强对血压的影响。方法构建在神经元特异性烯醇酶(NSE)启动子控制下的大鼠Kynu表达载体,采用受精卵原核注射的方法获得脑组织过表达Kynu的转基因小鼠。采用PCR鉴定转基因阳性小鼠;荧光实时定量逆转录PCR(Real Time RT-PCR)、蛋白免疫印迹技术(Western blot)免疫组织化学方法检测转基因的表达;高效液相色谱(HPLC)检测KYNU的活性;鼠尾法测量小鼠血压。结果转基因小鼠与同窝阴性对照小鼠相比,脑干组织中KYNU的表达有显著的差异(P<0.01),不同发育阶段转基因小鼠脑干组织Kynu活性与同窝阴性对照小鼠相比,存在显著差异(12周,0.1613±0.0153 vs.0.0019±0.0002 nmol/min/mg,P<0.01;35周,0.5817±0.1476vs. 0.0038±0.0004 nmol/min/mg,P<0.05;>1年,0.1909±0.0115 vs.0.0036±0.0011 nmol/min/ mg,P<0.01)。但两组小鼠的收缩压没有显著差异(12周,113.6±3.9 Vs.109.3±2.3 mmHg,P>0.05;35周,114.6±2.5 vs.113.1±4.2 mmHg,P>0.05;>1年,121.3±2.6 vs.123.9±3.5 mmH8,P>0.05)。给予游泳应激刺激后,两组小鼠间的血压也无显著差别。结论脑干组织Kynu的过表达并没有引起日间的和应激的血压值改变,KYNU在血压调节中的作用有待于进一步的研究。

人淋巴细胞犬尿氨酸酶活性的测定

目的 建立人淋巴细胞犬尿氨酸酶活性的高效液相色谱检测法。方法 以人淋巴细胞总蛋白作为酶的来源，以3-羟基犬尿氨酸为底物，5’磷酸吡哆醛为辅酶，进行酶促反应，产物经ODS色谱柱分离后用荧光检测器定量检测，从单位时间内产物的增加量来计算犬尿氨酸酶的催化活性。结果 该方法检测产物的线性范围是2～400nmol／L。方法的重复性好，日内变异系数（CV）≤3．0％，日间CV≤3．2％。结论 该方法适用于测定各种生物组织样本中犬尿氨酸酶的活性。

野生型犬尿氨酸酶表达载体的构建及酶活性检测

目的构建野生型犬尿氨酸酶(KYNU)的真核表达载体,并分析其在HEK293细胞中的表达及其酶活性。方法抽提人肝脏细胞的总RNA,通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法获得KYNU基因全长cDNA,将野生型KYNU基因克隆到pcDNA载体质粒中,获得野生型pcDNA-KYNU重组表达质粒,经酶切鉴定和测序验证后转染HEK293细胞,用蛋白质印迹法技术检测野生型KYNU在细胞中的表达,用高效液相色谱法(HPLC)检测HEK293细胞表达的野生型KYNU酶蛋白的活性。结果通过测序及酶切鉴定野生型pcDNAKYNU重组表达质粒扩增后的PCR产物电泳结果显示构建成功,蛋白质印迹法结果显示转染有重组野生型cDNA-KYNU质粒的HEK293细胞能表达KYNU蛋白,HPLC结果显示野生型KYNU酶存在活性。结论成功构建野生型pcDNA-KYNU的真核表达载体,野生型重组质粒在HEK293细胞中能够表达KYNU并具有一定的酶活性。

犬尿氨酸酶在乳腺浸润性导管癌中的作用及其与突变型P53的关系

目的:探讨犬尿氨酸酶(KYNU)与突变型P53蛋白在乳腺浸润性导管癌(IDC)组织中的表达及临床意义。方法:用免疫组化法检测IDC组织中KYNU与突变型P53蛋白的表达的情况,分析KYNU与IDC患者临床病理因素及突变型P53的关系。结果:KYNU在IDC中的高表达率为51.9%,突变型P53蛋白在IDC中的阳性率为45.1%。KYNU的表达与T分期(P<0.001)、组织学分级(P=0.01)、分子亚型(P=0.032)、突变型P53表达(P=0.02)有关,高KYNU表达多存在于低T分期、低组织学分级、luminal型、突变型P53蛋白阴性IDC组织。结论:KYNU在IDC中可能具有潜在的抑瘤作用,其表达量的高低可能受突变型P53蛋白表达水平的影响。

犬尿氨酸羟化酶选择性抑制剂L-3-(邻甲氧基苯甲酰基)丙氨酸的简捷合成

从Boc-保护氨基的天冬氨酸苄酯出发,通过5步反应简捷地合成了犬尿氨酸羟化酶的选择性抑制剂L-3-(邻甲氧基苯甲酰基)丙氨酸(o-MBA).其中关键反应为锂试剂对Weinreb酰胺的亲核取代反应.

犬尿氨酸氨基转移酶和犬尿喹啉酸在自发性高血压大鼠中的变化

目的犬尿氨酸氨基转移酶(KAT)催化犬尿氨酸(KYN)生成犬尿喹啉酸(KYNA)。研究表明中枢KAT 及 KYNA 可能参与血压调节,但外周 KAT 变化及 KYNA 生成与血压的关系尚无报道。检测肾脏 KATⅡ基因表达,KAT 活性,及尿 KYNA 含量在自发性高血压大鼠(SHR)和 WKY 大鼠(正常对照组)的变化。方法采用实时定量 PCR 技术检测 KATⅡ基因表达,高效液相色谱(HPLC)检测尿 KYNA 及 KAT 活性(通过测定其酶促反应产物 KYNA)。结果虽然肾皮质和肾髓质 KATⅡ基因 mRNA 表达在 SHR 与 WKY 之间差异无统计学意义(P>0.05);但 SHR 肾皮质 KAT 的活性显著低于 WKY[(0.563±0.037)vs(1.037±0.131)μmol/(g·min),P=0.017]。同时发现 SHR 组尿 KYNA 含量在显著低于 WKY 组[(7.8±1.8)vs(19.9±3.5)μmol/24 h,P=0.013]。相关分析显示,肾皮质 KAT 的活性(r=-0.418,P=0.023)和尿 KYNA 含量(r=-0.723,P=0.001)与血压都呈显著负相关。结论 SHR 大鼠肾皮质 KAT 活性降低及尿 KYNA 含量减少,提示除中枢 KAT 及 KYNA变化外,肾皮质 KAT 活性变化导致的 KYNA 改变亦可能影响血压。

冈比亚按蚊犬尿氨酸甲酰胺酶抑制剂的虚拟筛选

【目的】利用计算机模拟技术,对冈比亚按蚊Anopheles gambiae犬尿氨酸甲酰胺酶(kynurenine formamidase,KFase)的潜在抑制剂进行虚拟筛选,以获得可以削弱冈比亚按蚊作为中间宿主传播疟疾等蚊媒疾病的候选杀蚊剂。【方法】下载冈比亚按蚊KFase的氨基酸序列,通过BLAST方法查询不同物种中的同源蛋白质,并利用MEGA6最大似然法(maximum likelihood method)构建进化树,选择适于作为模板的同源蛋白黑腹果蝇Drosophila melanogaster KFase晶体结构(PDB ID:4E14),对冈比亚按蚊KFase进行三维建模。利用随机森林算法对小分子化合物数据库进行筛选,并对筛选结果进行处理,模拟自然条件下有机小分子与冈比亚按蚊KFase的结合以及分子对接,从而筛选出冈比亚按蚊KFase的潜在抑制剂。【结果】获得3个小分子化合物与冈比亚按蚊KFase结合的亲和能较低,分别是:N-(2,4-diketo-1H-pyrimidin-6-yl)-2-fluoro-benzamide;3-(4-fluorophenyl)-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-5-carboxylic acid;N-(2-oxo-2,3-dihydro-1Himidazo[4,5-b]pyridin-5-yl)-succinamic acid。它们与冈比亚按蚊KFase结合的亲和能分别为:-9.0,-8.7和-8.9 kcal/mol。【结论】N-(2,4-diketo-1H-pyrimidin-6-yl)-2-fluoro-benzamide,N-(2-oxo-2,3-dihydro-1H-imidazo[4,5-b]pyridin-5-yl)-succinamic acid和3-(4-fluorophenyl)-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-5-carboxylic acid是冈比亚按蚊犬尿氨酸甲酰胺酶的潜在竞争性抑制剂,这些化合物是否可作为杀蚊剂的候选化合物有待实验验证。

高效液相色谱——紫外、荧光双检测器同时测定人尿中犬尿氨酸和犬尿喹啉酸

目的建立高效液相色谱(HPLC)同时测定人尿中犬尿氨酸(KYN)和犬尿喹啉酸(KYNA)方法。用KYNA/KYN比值评价人体犬尿氨酸氨基转移酶(KAT)活性。方法采用HPLC测定KYN、KYNA,分析柱为安捷伦HCC18反相色谱柱;流动相为10mmol/L乙酸钠-乙酸缓冲液∶7%乙腈=93∶7;流速1mL/min;检测器波长:紫外365nm,荧光344nm(激发)/398nm(发射)。结果KYN和KYNA保留时间分别为6.9和11.5min。水溶液标准与标准加入工作曲线斜率差异无统计学意义(KYN:P=0.4068;KYNA:P=0.6462)。KYN和KYNA的平均回收率分别为98.74%±7.53%、95.17%±8.17%;稳定性试验的变异系数(CV)分别为3.35%和0.88%;精密度CV分别为2.73%和2.79%;最低检测限分别为0.4和0.2μmol/L。30份健康成年人尿样的KYNA/KYN比值为2.45±1.54。尿中KYNA与KYN含量呈正相关关系(r2=0.3758,P<0.001)。结论测定方法灵敏、准确、稳定。KYNA/KYN比值评测KAT活性具有简便、实用等特点,可用于相关疾病的临床辅助诊断和基础研究。

原发性高血压患者血浆色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸浓度的变化

目的通过测定血浆色氨酸(TRP)、犬尿氨酸(KYN)和犬尿喹啉酸(KYNA)浓度,探讨外周吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)和犬尿氨酸氨基转移酶(KAT)活性与原发性高血压(EH)的关系。方法采用高效液相色谱法(HPLC)测定100例EH患者和80名健康体检者(对照组)血浆TRP、KYN和KYNA浓度,计算产物/底物的百分比来评价酶活性,即IDO活性=KYN/TRP×100%,KAT活性=KYNA/KYN×100%。结果 EH组血浆TRP浓度为(59.85±9.89)μmol/L,明显高于对照组[(48.19±7.72)μmol/L,P<0.001];KYN浓度为(2.01±0.48)μmol/L,明显低于对照组[(2.17±0.43)μmol/L,P<0.05]。EH组和对照组血浆KYNA浓度分别为(24.10±9.12)、(23.59±7.27)μmol/L,二者差异无统计学意义(P>0.05)。EH组IDO活性为3.40%±0.85%,明显低于对照组(4.54%±0.81%,P<0.001);而KAT活性为1.20%±0.36%,明显高于对照组(1.09%±0.27%,P<0.05)。EH组血浆TRP浓度与年龄呈负相关(r=-0.316,P=0.001),而对照组二者之间无明显相关性(r=-0.208,P=0.064)。EH组和对照组血浆IDO活性均与年龄呈正相关(EH组:r=0.264,P=0.008;对照组:r=0.305,P=0.006)。2组血浆KYN、KYNA浓度及KAT活性与年龄均无明显相关性。结论EH组血浆TRP浓度明显增高而KYN浓度明显降低,提示外周TRP-KYN代谢途径的IDO活性可能与EH有关。

口腔鳞状细胞癌组织中IDO1、KYNU表达情况与临床病理特征及预后的关系

目的探讨口腔鳞状细胞癌(OSCC)组织中吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)、犬尿氨酸酶(KYNU)表达情况与病理特征、预后的关系。方法将2018年1月至2020年6月该院收治的98例OSCC患者纳入研究。收集患者OSCC组织标本及对应的癌旁组织标本。采用免疫组化法检测组织中IDO1、KYNU的表达情况,分析IDO1、KYNU表达情况与OSCC患者临床病理特征的关系。采用多因素Cox回归分析OSCC患者预后的影响因素。结果OSCC组织IDO1、KYNU阳性表达率高于癌旁组织(P<0.05)。OSCC分化程度低分化、浸润深度(DOI)>5 mm、淋巴结转移、临床分期Ⅲ~Ⅳ期的患者IDO1、KYNU阳性表达率分别高于OSCC分化程度中高分化、DOI≤5 mm、淋巴结无转移、临床分期Ⅰ~Ⅱ期的患者(P<0.05)。OSCC分化程度中高分化、DOI≤5 mm、淋巴结无转移、临床分期Ⅰ~Ⅱ期、IDO1阴性、KYNU阴性患者的3年总生存率分别高于OSCC分化程度低分化、DOI>5 mm、淋巴结转移、临床分期为Ⅲ~Ⅳ期、IDO1阳性、KYNU阳性患者(P<0.05)。多因素Cox回归分析显示,DOI>5 mm(HR=3.225,95%CI:1.496~6.954),IDO1阳性(HR=3.714,95%CI:1.941~7.105),KYNU阳性(HR=4.150,95%CI:1.887~9.124)是OSCC患者预后的影响因素(P<0.05)。结论IDO1、KYNU在OSCC患者癌组织中呈高表达,与OSCC的DOI、临床分期、分化程度等特征密切相关,有望作为辅助评估患者预后的标志物。

胰腺癌组织中KYNU mRNA的表达及其与免疫浸润和预后的相关性研究

目的研究犬尿氨酸酶(kynureninase,KYNU)在胰腺癌组织中的表达及其与免疫浸润和预后的关系。方法选取2019年1月~2021年6月于无锡市第五人民医院普外科行手术治疗的49例可切除胰腺癌患者为研究对象,均经病理学及影像学诊断为可切除胰腺癌,肿瘤TNM分期为Ⅰ~Ⅲ期,术前均为接受新辅助治疗,收集其胰腺癌组织和对应癌旁组织(距离癌灶≥4 cm)标本。采用免疫组织化学染色法检测胰腺癌组织及对应的癌旁组织中KYNU蛋白表达及癌组织中CD8^(+)TILs,CD103^(+)TILs,CD68^(+)TAMs,CD204+TAMs和CD11c+DCs浸润情况,实时荧光定量PCR反应检测KYNU mRNA的相对表达量,Pearson相关分析、Kaplan-Meier生存曲线、COX比例风险回归模型分析KYNU mRNA表达与免疫浸润和预后的关系。结果胰腺癌组织中KYNU蛋白阳性率(77.6%)及mRNA表达量(2.9±0.7)显著高于癌旁正常组织(38.8%,0.8±0.5),差异具有统计学意义(χ^(2)=15.138,t=17.088,均P<0.05);KYNU高表达组CD8^(+)TILs,CD103^(+)TILs,CD68^(+)TAMs,CD204+TAMs及CD11c+DCs的浸润数目显著高于KYNU低表达组,差异具有统计学意义(t=2.533~5.806,均P<0.05);胰腺癌中KYNU mRNA表达与CD8^(+)TILs,CD103^(+)TILs,CD68^(+)TAMs,CD204+TAMs及CD11c+DCs的浸润数目呈正相关(r=0.514,0.502,0.319,0.415,0.438,均P<0.05);KYNU高表达组累积OS及累积DFS显著低于KYNU低表达组(20.0%vs 42.9%,14.3%vs 35.7%),差异均有统计学意义(Log Rankχ^(2)=4.358,4.273,P=0.039,0.042)。多因素COX回归分析结果显示,TNM分期Ⅲ期(HR:1.653,95%CI:1.294~1.937)、低分化(HR:1.671,95%CI:1.284~2.003)、淋巴结转移(HR:1.582,95%CI:1.117~1.896)、KYNU高表达(HR:1.591,95%CI:1.106~1.902)是影响胰腺癌预后的独立危险因素(均P<0.05)。结论KYNU在胰腺癌组织中显著高表达,与胰腺癌免疫浸润及临床预后密切相关,可能成为胰腺癌预测预后的潜在生物标志物。

脑梗死患者血清IDO及KAT比活性测定

目的 探讨吲哚氨2,3-双加氧酶（IDO）及犬尿氨酸氨基转移酶（KAT）活性在脑梗死患者中的变化情况及病理作用.方法 正常对照组35例和脑梗死组81例,采用免疫透射比浊法测定血清超敏C反应蛋白（hsCRP）、载脂蛋白A1（APOA1）、载脂蛋白B（APOB）浓度,采用酶法分析甘油三酯（TG）、总胆固醇（CHO）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、游离脂肪酸（NEFA）浓度,采用HPLC-荧光衍生法测定血液色氨酸（TRP）、犬尿氨酸（KYN）及犬尿喹啉酸（KYNA）浓度,计算IDO及KAT比活性,并进行对照分析.结果 脑梗死组TRP、KYNA、HDL、KAT比活性明显低于对照组（P均＜0.05）.脑梗死组hsCRP、IDO比活性明显高于对照组（P均＜0.01）.脑梗死患者IDO比活性与hsCRP呈正相关（r=0.425,P=0.027）.结论 脑梗死患者体内存在炎症反应,炎症应答上调IDO的活性表达,进而影响KYN代谢途径,可能与脑梗死患者的病理生理密切相关.