基于不同抗原的犬布鲁氏菌病免疫层析胶体金抗体试纸条的制备和比较

为建立针对犬布鲁氏菌病的免疫层析胶体金快速检测方法,利用从犬种布鲁氏菌菌株提纯的膜蛋白和可溶性蛋白,原核表达纯化的外膜蛋白Omp31和BP26以及基于B细胞抗原肽的融合蛋白F14,分别制备了试纸条,然后采用犬布鲁氏菌病阳性和阴性血清,分别对上述试纸条进行敏感性和特异性比较。结果显示:Omp31抗原的敏感性最高,其次是F14和BP26,而全菌膜蛋白和全菌可溶性蛋白的敏感性较差;特异性上,使用由5种抗原制备的胶体金试纸条检测30份犬布鲁氏菌病阴性血清,结果均为阴性;5种试纸条与沙门氏菌、大肠杆菌(O157)、大肠杆菌(H7)、霍乱弧菌、副溶血弧菌、军团菌阳性血清均不发生交叉反应。另外,由F14和BP26制备的试纸条可识别羊布鲁氏菌病阳性血清,而由Omp31、全菌膜蛋白和全菌可溶性蛋白制备的试纸条均不能识别牛、羊布鲁氏菌病阳性血清。综上所述,Omp31、F14和BP26可作为制备犬布鲁氏菌病免疫层析胶体金检测卡的备选抗原。本研究为粗糙型布鲁氏菌引起的布鲁氏菌病的诊断提供了技术支撑。

犬布鲁氏菌菌壳疫苗的制备

菌壳技术是一种新型的灭活疫苗制备方法,通过非变性的灭活方式保存细菌表面多个抗原表位,所制备的菌壳可作为预防细菌病的理想疫苗。本试验从噬菌体PhiX174DNA钓取裂解E基因,连接至温控原核表达载体pBV220,通过PCR在所构建的pBV220+E上扩增出蛋白裂解部件(protein lysis component,PLC),该部件包含阻遏蛋白cI857、溶菌E基因及终止序列rrnbT1T2,然后将其克隆至广宿主表达载体pBBR1MCS-2中,最终将构建的广宿主裂解质粒pBBR+PLC电转入犬布鲁氏菌RM6/66中。试验结果表明,经42℃诱导后,广宿主裂解质粒对犬布鲁氏菌RM6/66的裂解率达100%,成功制备了犬布鲁氏菌RM6/66菌壳疫苗。本试验通过菌壳技术制备的犬布鲁氏菌疫苗对预防宠物犬布鲁氏菌病起到重要作用,同时也对人兽布鲁氏菌疫苗的研制提供新策略。

犬布鲁氏菌病

目前,犬布鲁氏菌病在全球多个国家和地区都有发生,而且发病数量逐年上升,由犬布鲁氏菌病感染人的病例报道也日益增多。因此,犬布鲁氏菌病的控制和根除对人类健康和公共卫生安全具有重要的意义。据报道,我国多个省份存在犬布鲁氏菌病,而且感染和发病率有上升的趋势。由于我国养犬数量巨大,犬与人类接触密切,病犬作为人类布鲁氏菌病的传染源不容忽视。犬布鲁氏菌病的研究起步较晚,流行病学资料欠完善,公共卫生学意义有待阐明,诊断、免疫预防等诸多问题还没完全解决,加强犬布鲁氏菌病的研究和防控应引起足够的重视。本文就犬布鲁氏菌病的病原学、流行病学、病理学、临床症状、诊断、治疗、预防及公共卫生安全等分别做一阐述。

北京地区犬布鲁氏菌病血清学调查结果及分析

为了了解北京地区犬布鲁氏菌病的流行情况和规律,本文对不同来源犬的血清样品进行了血清学检测,结果显示北京地区犬布鲁氏菌病疫情呈回升趋势。该结果为预测北京地区布鲁氏菌病流行趋势,制定防治对策及措施提供了科学依据。

2016—2017年山东省济南市犬布鲁氏菌病血清流行病学调查

为初步了解山东省济南市犬布鲁氏菌病流行情况,2016—2017年,在济南市5个辖区采集502份犬血样,利用竞争ELISA抗体试剂盒、虎红平板凝集试验,分别检测光滑型(猪、牛、羊种)和粗糙型(犬种)布鲁氏菌抗体。结果显示,济南市犬布鲁氏菌光滑型、粗糙型抗体阳性率分别为8.76%、1.99%。结果表明,济南市宠物犬中的光滑型布鲁氏菌感染率较高,潜在传播风险较大,应引起高度重视。

犬布鲁氏菌病的组织病理学观察及病原分布检测

布鲁氏菌病主要引起公犬的睾丸炎、附睾炎并造成不育.该文对一例患布病公犬各器官的组织进行了病理学以及抗原分布分析.结果表明,肝脏、脾脏、睾丸、淋巴结呈现广泛的炎性细胞浸润与实质细胞变性坏死,脾脏中观察到大量感染性肉芽肿.免疫组化结果表明,布鲁氏菌抗原主要分布于肝、脾、睾丸组织中的巨噬细胞和中性粒细胞胞浆中,与巨噬细胞的亲和力最强.

北京地区宠物犬布鲁氏菌的分离与鉴定

自2012年11月至2013年6月,本实验室对北京市某动物医院送检的疑似患布鲁氏菌病宠物犬的38份血清进行抗体检测,22份阴道分泌物和2份抗凝血进行细菌分离。结果显示,18只宠物犬抗体检测为阳性,并且从5只抗体阳性的宠物犬体内还各分离到一株布鲁氏菌,其中4株为犬种布鲁氏菌,另一株生物型尚待确定。通过调查及临床症状的观察,推测病犬排泄物、流产物或者与病犬交配等可能导致布鲁氏菌病的传播,这为北京市宠物犬布病的流行性调查提供了一定的数据支持。

一株犬种布鲁氏菌的分离鉴定及其在巨噬细胞内存活能力的研究

为分离鉴定流产犬的致病病原及其生物学特性,本研究从重庆某宠物医院无菌采集流产犬全血2份,将其涂布于布鲁氏菌选择培养基,分别在不含CO_(2)和含7.5%CO_(2)条件下37℃培养72 h,观察菌落形态,并经结晶紫染色,观察细菌类型。按照国家标准鉴定分离菌的生化特性。细菌分离结果显示,在不含CO_(2)和含7.5%CO_(2)的培养箱中2份流产犬全血样品在布鲁氏菌选择培养基上均长出边缘整齐、光滑的圆形菌落,透射光下,菌落呈浅黄色且有光泽;结晶紫染色结果显示分离菌为典型的粗糙型细菌;生化鉴定结果显示,分离株在TSA中的生长不依赖于CO_(2),且不产生H2S,氧化酶和脲酶试验均为强阳性。上述结果表明分离到一株犬种布鲁氏菌,命名为B. canis CQ3。对分离菌进行全基因组测序,利用MAUVE对分离株与GenBank中38株不同种的布鲁氏菌基因组进行比对,并构建分离菌全基因组的进化树。将不同种布鲁氏菌及分离株分别接种于TSB培养基中,通过测定不同时间的OD450nm值绘制各菌株的生长曲线。将各菌株及B. canis CQ3株分别以MOI 100感染小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7,在感染后的不同时间(1 h、24 h、48 h和72 h)收集细胞,经相应处理后涂布TSA平板培养72 h后,经菌落计数分析分离菌株在细胞中的存活能力。全基因组序列比对及进化树结果显示,比对到犬种布鲁氏菌的序列数量最多,且B. canis CQ3株与欧洲分离的犬种布鲁氏菌NR-finland株的亲缘关系最近。生长曲线测定结果显示,在6 h~16 h (对数生长期) B. canis CQ3株的生长速度稍快于羊种布鲁氏菌B. melitensis XJ流行株和牛种布鲁氏菌B. abortus DT流行株;整个生长过程中B. canis CQ3株的生长速度与疫苗株A19和S2基本一致。巨噬细胞感染试验结果显示,感染1 h时,B. canis CQ3株进入巨噬细胞数量多于疫苗株A19和S2、B. melitensis XJ和B. abortus DT株。相比B. melitensis XJ和B. abortus DT株,B. canis CQ3株在胞内的活菌数均有所降低(感染后24 h)和极显著降低(感染后48 h)(P<0.001),但一直与疫苗株A19和S2在胞内的的活菌数相当。相比于感染后24 h,感染后48 h B. canis CQ3株的胞内活菌数升高了近10倍。上述结果表明,本研究分离鉴定的B. canis CQ3株的体外生长特性与疫苗株A19和S2基本一致,但在对数期的生长稍快于B. melitensis XJ株和B. abortus DT株,且其在RAW264.7细胞中的存活能力较好。本研究首次系统比较了犬种布鲁氏菌分离株与疫苗株A19、S2以及牛羊布鲁氏菌流行株在鼠源巨噬细胞中的存活能力,为进一步开展犬种布鲁氏菌病原学和流行病学调查提供了参考依据。

犬布鲁氏菌免疫程序设计

本研究旨在制定出灭活犬种布鲁氏菌的免疫BALb/C小鼠的最佳免疫程序。选用40只6~8周BALb/C雌性小鼠,随机分为试验组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组及对照组,每组10只。制定3种不同的免疫程序,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组三免7 d后尾部采血测血清效价,Ⅲ组四免后小鼠尾部采血测定血清效价。结果表明,3种免疫程序均可行,其中Ⅱ组免疫程序最佳。即首次免疫剂量为1×10~9 CFU/只,抗原与佐剂等比例乳化;两周后进行二免,剂量为2×10~9 CFU/只,抗原与佐剂等比例乳化;两周后进行三免,剂量为3×10~9 CFU/只,抗原与佐剂等比例乳化,融合前3 d不加佐剂加强免疫,剂量为4×10~9 CFU/只。

基于比较基因组学方法的世界范围的犬布鲁氏菌系统发育群研究

犬布鲁氏菌病是一种世界范围内导致家畜流产和人波状热的人畜共患病,最近随着相关宿主动物如犬类饲养数量的增多,家庭儿童的感染案例报道屡见不鲜,所以研究犬布鲁氏菌具有重要公共卫生意义。使用了全球的91个菌株,利用贝叶斯方法对菌株分群,基于core-SNPs和分子钟模型构建进化树进行种群结构和时空分布分析,使用COG功能聚类进行功能差异研究。发现的4个系统发育群(PG)与它们的地理来源显著相关,PG1~3中,存在亚洲到非洲及欧美间的传播;PG4定殖于北美,且耐药基因逐渐缺失。功能基因在4个PG中的存在/缺失谱不同,PG3功能最完整,其他PG各具独特的功能基因缺失,特别是PG2大多缺失ABC型转运系统组分。掌握犬布鲁氏菌在全球的分布和传播,理解其基因组变异有助于开发新的诊断和疫苗靶点,以对抗由犬布鲁氏菌引起的人类流行病。

1例结石患犬尿液中犬种布鲁氏菌的分离与鉴定

本试验从1例因膀胱尿道结石而行膀胱切开术和公犬去势术患犬的膀胱中采集尿液,进行常规细菌分离培养,获得1株生长缓慢的革兰阴性细菌,经飞行质谱鉴定、16S rDNA序列分析,确定分离菌株为布鲁氏菌属细菌;经布鲁氏菌Ladder-PCR鉴定,进一步确定该分离菌株为犬种布鲁氏菌。于术后14 d和60 d再次膀胱穿刺法采集患犬尿液进行细菌分离,获得的细菌经鉴定仍为犬种布鲁氏菌,且随着时间增长细菌数量呈递增趋势。本试验结果提示,犬种布鲁氏菌可能为犬膀胱结石的致病因子,且经尿液排泄对环境造成的污染具有重大公共安全隐患。

一株犬种布鲁氏菌的鉴定及毒力测定

对分离到的一株疑似犬种布鲁氏菌进行生物特性和基因型鉴定,并用宿主实验动物(比格犬)测定了最小感染量和脾含菌量。形态与染色特性、培养特性、血清学特性、生化特性鉴定以及Multi-PCR和16S rRNA测序结果表明,该分离株为犬种布鲁氏菌,其对比格犬的最小感染剂量为10~5 CFU/m L,对应的脾含菌量为4×10~5~3×10~6 CFU/g。

一株犬种布鲁氏菌的分离与鉴定

对从一只流产贵宾犬全血中分离到的一株布鲁氏菌进行了形态结构、培养特性、生化特性研究以及凝集试验鉴定和多种属聚合酶链式反应(AMOS-PCR)鉴定。结果表明,分离菌为革兰氏阴性菌,在胰眎琼脂培养基生长并呈典型的粗糙型布鲁氏菌菌落,菌落能被结晶紫溶液染成紫色。分离菌在琉瑾和复红培养基上生长,不产生H2S,与粗糙型布鲁氏菌阳性血清凝集,与光滑型布鲁氏菌阳性血清无凝集。用AMOS-PCR方法对分离菌进行鉴定,该分离菌具有犬种布鲁氏菌特有条带。鉴定结果表明分离菌符合犬种布鲁氏菌特性,将其命名为B.canis GB1。

犬种布鲁氏菌研究进展

犬种布鲁氏菌属于6个经典种布鲁氏菌之一,为天然粗糙型,毒力较弱。长期以来,由于犬种布鲁氏菌对人类致病性较低,其危害一直被忽视。自1966年在美国发现该菌以来,已传播至世界多地。近年来,随着养犬业的不断发展及宠物犬数量的增多,犬布鲁氏菌病发病率不断上升,在某些地区已成为流行性疫病,且对人类公共卫生安全的威胁也日益加重。目前,犬种布鲁氏菌感染导致的犬布鲁氏菌病尚无可靠的诊断方法及有效的疫苗。鉴于此,在查阅相关文献的基础上,笔者对犬种布鲁氏菌的病原学、流行病学、致病机理、检测方法、疫苗研究等方面的相关研究进展进行综述,以期为犬布鲁氏菌病的深入研究和防控提供参考。

辽宁省首次发现犬种布鲁氏菌病的报告

辽宁省1988年对10个市的48个县(区)50个乡(镇)92个村(屯)中的1555只家犬做了犬种布鲁氏菌感染情况调查。在其中6个县(区)共查出血清阳性犬29只。检测接触阳性犬的人血清90份,阳性1份,疑似12份。在18只血清阳性犬的脏器中培养分离出犬种布鲁氏菌14株。首次证实辽宁省存在犬种布鲁氏菌病疫源地。

虎红平板凝集试验在犬种布鲁氏菌病调查中的应用

用犬种布鲁氏菌制备虎红平板凝集试验粗糙型抗原进行犬种布鲁氏菌病调查,并采用虎红平板凝集定量试验以及2-ME和葡萄球菌甲蛋白(SPA)处理血清后试验的方法,初步探讨了虎红平板集试验在犬种布鲁氏菌病调查中的用价值。

宠物犬的犬种布鲁氏菌病的诊断和治疗方法探讨

布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌属细菌引起的人兽共患的常见传染病。犬种布鲁氏菌(B.canis)是布鲁氏菌属的一个种,其危害程度略低于羊、牛和猪种布鲁氏菌,主要感染犬,也可以感染猪、牛、羊等动物,对人的感染鲜有报道,但国内1980~1996年曾有人感染的案例[1,2,3],潜在的公共卫生意义较大。

广西犬种布鲁氏菌毒力测定

为证实我区分离的犬种布氏菌的致病性，我们根据菌株的抗原性、药敏试验及地区分布，选出毒力较强的有代表性的广西株，同时与ＲＭ６／６６参考株分别接种小白鼠和做青霉素毒力测定，小白鼠经皮下接种后，第７天处死解剖，所有脏器均分离出菌。两株广西株在含１０ＩＵ／ｍｌ的青霉素培养基上仍可生长。而ＲＭ６／６６参考株能生长的最高浓度为５ＩＵ／ｍｌ。

桂林地区犬种布鲁氏菌病的调查

自1985年首次从本地区农村家狗中分离出犬种布鲁氏菌(B·canis)后,我们继续开展犬种布鲁氏菌病的调查研究,现将结果报告如下。 材料与方法 一、调查对象 本地区各县农村居民喂养的家狗、与狗密切接触者。 二、抗原及诊断制剂 B.canis抗原,A、M。