犬新孢子虫miRNAs的鉴定与分析

为鉴定犬新孢子虫(Neospora caninum)特异表达的miRNAs,并研究其在宿主细胞中的表达情况,本研究收集N.caninum速殖子感染的山羊子宫内膜上皮细胞(caprine endometrial epithelial cells,EECs)24和48 h的样本,用Illumina高通量测序平台和生物信息学分析犬新孢子虫特异表达的miRNAs及其体外表达情况,并研究了一个上调的miRNA novel3_mature对犬新孢子虫在山羊EECs增殖的影响。结果发现,共鉴定出3404个犬新孢子虫特异表达的miRNAs(155个新预测miRNAs),其中77个(47个上调和30个下调)miRNAs显著差异表达;随机选取7个显著差异表达的miRNAs进行实时荧光定量PCR分析,结果与高通量测序结果一致;预测分析发现61个miRNAs的3978个靶基因,功能富集分析发现这些靶基因可能主要参与MAPK信号通路、突触导向、黏着斑、cMAP信号通路、钙信号通路等;转染novel3_mature的模拟物显著促进犬新孢子虫在山羊EECs中的增殖。犬新孢子虫存在多个特异表达的miRNAs,其在虫体增殖中发挥重要作用,研究成果为深入理解犬新孢子虫胞内生存提供了新的思路。

奶牛犬新孢子虫流产诊疗防

新孢子虫病是由犬新孢子虫(Neospora caninum)引起的一种世界范围内流行的多种动物共患原虫病,给畜牧业造成了严重的经济损失,并潜在威胁人类健康。鉴于国内大部分奶牛场对犬新孢子虫感染危害认识不足或根本无知,本文以某规模化奶牛场发生的犬新孢子虫病为例,简述奶牛犬新孢子虫病的临床症状、诊断和预防措施,为奶牛犬新孢子虫流产诊疗防提供参考。

新疆和静县黑头羊犬新孢子虫的检测及分子鉴定

犬新孢子虫是一种细胞内原生动物寄生虫,可导致包括绵羊和山羊在内的多种哺乳动物流产和新生胎儿死亡。本研究为了预估巴音郭楞蒙古自治州和静县黑头羊中犬新孢子虫的流行情况,采集了8个乡镇的165份血样,运用聚合酶链式反应(PCR)扩增犬新孢子虫Nc5基因片段,并对部分阳性产物进行基因测序。结果显示,在165只黑头羊中有13只(7.9%)检测到犬新孢子虫阳性;年龄、流产史、饲养犬只与感染率有统计学差异(P<0.05);2岁以上的母羊感染率最高,有流产史的母羊,新孢子虫感染率较高。饲养场地周边犬的存在对感染率也有所影响,有饲养犬的羊群感染率11.4%,高于未饲养犬的羊群。将Nc5基因的部分序列与GenBank上传的基因序列进行比对,结果显示同源性为92%~100%。本研究是首次对和静县黑头羊犬新孢子虫进行系统进化分析,为犬新孢子虫病防控方案的制订提供参考,对减少畜牧业的经济损失具有实际意义。

吉林株犬新孢子虫的分离与鉴定

将疑似感染犬新孢子虫而流产的牛胎儿脑组织接种于Vero细胞进行体外培养,同时感染长爪沙鼠进行动物试验。提取牛流产胎儿脑组织DNA、沙鼠脑组织DNA、细胞培养虫体DNA,用犬新孢子虫特异性引物进行PCR扩增。结果显示,PCR扩增出了1条约为681 bp的目的条带;测序结果表明,扩增出的特异性目的基因序列与GenBank中发表的犬新孢子虫NcSAG1基因(AF113004)核苷酸序列的同源性为99.4%。结果表明,在吉林省牛流产胎儿脑组织中分离出犬新孢子虫。

河南省奶牛犬新孢子虫病流行病学调查

奶牛犬新孢子虫病是由孢子虫纲、真球虫目、新孢子虫属的犬新孢子虫引起的多种动物共患的一种原虫病,本病奶牛、肉牛均能感染,但对奶牛的危害严重,主要引起孕畜流产或死胎以及新生儿运动神经障碍等。目前有许多国家和地区报道有该病发生,我国一些省份和地区陆续有报道该病的发生和流行病学调查,为了解河南省奶牛犬新孢子虫病的感染情况,我们于2009年8～10月间对河南省5个地区27家奶牛场的468头奶牛进行了犬新孢子虫抗体检测,证实本省以上5个地区均有该病感染。

进口奶牛犬新孢子虫病血清学抗体及流产胎儿病原分子生物学检测

采用间接免疫荧光抗体试验对随机抽取的3批进口奶牛1 238份奶牛血样进行牛新孢子虫病的流行病调查。随后用乳胶凝集对牛新孢子虫抗体阳性样品进行弓形虫抗体检测。并用已建立的牛新孢子虫病巢式PCR(Nested-PCR)对第一批进口奶牛的数十头流产胎儿进行牛新孢子虫病的病原分子生物学检测。结果表明,3批进口奶牛的新孢子虫整体感染率为6.54%,所有奶牛犬新孢子虫抗体阳性血清的弓形虫抗体全部为阴性。新孢子虫血清抗体阳性母牛流产的胎儿经Nested-PCR检测,60%胎儿为阳性,而抗体阴性母牛流产的胎儿经Nested-PCR检测均为阴性。

表达牛源犬新孢子虫NcSRS2基因重组腺病毒的构建及免疫原性分析

为构建牛源犬新孢子虫NcSRS2基因重组腺病毒,并分析其免疫原性,PCR扩增牛源犬新孢子虫Nc-SRS2基因,构建克隆质粒pMD18-T-NcSRS2、重组腺病毒穿梭质粒pCR259-NcSRS2及表达质粒Transpose-Ad-NcSRS2,脂质体介导转染QBI-HEK293细胞,包装重组腺病毒Ad5-NcSRS2,PCR检测重组腺病毒NcSRS2基因,IFAT和Western blotting检测NcSRS2基因在QBI-HEK293细胞中的表达,测定病毒滴度后,收集病毒液免疫BALB/c小鼠,间接ELISA检测小鼠血清IgG抗体水平。结果显示,扩增的牛源犬新孢子虫NcSRS2基因大小为1 227bp,与GenBank中发表的NcSRS2(AF061249)核苷酸序列相似性为99%;重组腺病毒Ad5-NcSRS2在293细胞中包装成功,表达蛋白的相对分子质量为43ku,具有较好的反应原性;测得重组腺病毒Ad5-NcSRS2滴度为109 TCID50.mL-1,间接ELISA检测二免后3周BALB/c小鼠血清中IgG抗体效价达1∶2 048。本研究成功构建了具有良好免疫原性的重组腺病毒Ad5-NcSRS2,为牛源犬新孢子虫NcSRS2基因重组腺病毒载体疫苗的研制奠定了基础。

青海省海西地区山羊和绵羊犬新孢子虫病的血清学调查

用犬新孢子虫的重组蛋白GST-NcSAG1t作为ELISA诊断抗原,进行了青海省海西地区山羊和绵羊群中犬新孢子虫病的血清学调查。经过对所收集的120份绵羊血清和531份山羊血清抗体的检测,共检出绵羊阳性血清10份,山羊阳性血清36份,其阳性率分别为8.33%和6.78%。说明青海省海西地区的绵羊和山羊群中存在犬新孢子虫的感染。

皖浙两省部分地区宠物犬肠道中犬新孢子虫的感染情况

目的 了解安徽省和浙江省宠物犬肠道中犬新孢子虫的感染情况。 方法 2013年4-12月从安徽省合肥市包河区、宣城市宣州区、滁州市凤阳县和明光市、蚌埠市龙子湖区和宿州市泗县，以及浙江省杭州市余杭区的宠物门诊采集315份新鲜宠物犬粪样。所有样品处理后先采用基于犬新孢子虫特异基因NCLI-004830的巢式PCR方法进行检测，随后对阳性样品进行PCR扩增和分析其内转录间隔区1（ITS1）序列以进一步验证。 结果 315份粪样中NCLI-004830基因巢式PCR共扩增出5份犬新孢子虫DNA阳性样品，产物大小为420 bp，阳性率为1.6%，滁州和蚌埠宠物犬的阳性率分别为3.4%（3/89）和6.5%（2/31），其余调查点未发现犬感染犬新孢子虫。5份NCLI-004830基因阳性样品的ITS1序列经PCR扩增后，均扩增出137 bp的条带，序列鉴定正确。成年犬和幼龄犬之间，雄性犬和雌性犬之间差异均无统计学意义（P＞0.05）。 结论 安徽省滁州和蚌埠的宠物犬有犬新孢子虫感染。

牛源犬新孢子虫NcGRA7基因的克隆及原核表达分析

为了解牛源犬新孢子虫NcGRA7基因的生物学特性,本实验采用PCR技术扩增牛源犬新孢子虫NcGRA7基因,并连接至pMD-18T载体中,构建重组质粒pMD18-NcGRA7,经PCR、酶切鉴定及测序分析,将NcGRA7基因连接到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-NcGRA7,转化大肠杆菌BL21,筛选阳性克隆,将PCR和酶切鉴定正确的重组质粒进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE和western blot分析表达产物。结果表明,扩增的NcGRA7基因片段大小为701 bp,编码233个氨基酸,与GenBank中登录的NcGRA7(AF176649)核苷酸序列同源性为98.7%;western blot分析表达蛋白的分子量为52 ku,具有较好的反应原性。本实验为犬新孢子虫NcGRA7基因疫苗研究奠定了基础。

犬新孢子虫NcSRS2基因片段的克隆及原核表达

以含有犬新孢子虫NcSRS2基因的质粒pMD18-NcSRS2为模板,应用PCR方法扩增Nc-SRS2基因,将该基因片段克隆至原核表达载体pGEX-4T-2,构建了重组表达质粒pGEX-Nc-SRS2,转化大肠杆菌BL21中并诱导表达。结果显示,克隆的基因片段长1100bp,SDS-PAGE、Western blotting分析显示,重组质粒pGEX-NcSRS2在大肠杆菌中得到了高效表达。

犬新孢子虫NcSRS2基因真核表达质粒的构建

根据犬新孢子虫NcSRS2基因序列,设计了1对含有Kozak序列、PstⅠ和XbaⅠ酶切位点的引物,以含有NcSRS2基因的质粒P43为模板,经PCR扩增获得NcSRS2ORF基因片段,用PstⅠ和XbaⅠ双酶切该片段,回收得到含有以上2个酶切位点黏端的NcSR2ORF基因,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pcDNA3.1(+)真核表达载体中,获得重组质粒pcNCSRS2。经PCR鉴定、限制性内切酶分析和克隆片段序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性。

牛源犬新孢子虫对BABL/c孕鼠胎盘激素和细胞因子调节功能的影响

旨在探讨牛源犬新孢子虫对孕鼠胎盘激素和细胞因子调节功能的影响。以牛源犬新孢子虫BABL/c孕鼠感染模型为研究对象,同时设置正常对照组孕鼠,在攻虫第12、14、16、18天分批处死孕鼠,采集孕鼠血清,制备孕鼠胎盘细胞悬液,采用ELISA方法对牛源犬新孢子虫感染孕鼠血清中CRH、CG、PRL及E3等胎盘激素水平,以及孕鼠胎盘细胞悬液中IFN-γ、IL-4及TGF-β等细胞因子水平进行检测。结果显示,与正常对照组孕鼠比较,牛源犬新孢子虫感染孕鼠模型随攻虫时间的增加,在孕鼠血清中,CRH水平在第12天时显著升高(P<0.05),在第18天时显著下降(P<0.01);CG水平在第12天时显著下降(P<0.01),在第16天时显著升高(P<0.05);PRL水平在第18天时显著下降(P<0.05);E3水平在第12天时显著升高(P<0.05),第16天时显著下降(P<0.05)。在孕鼠胎盘细胞悬液中,IFN-γ水平在第18天时显著升高(P<0.05);IL-4水平在第12天时显著升高(P<0.05);TGF-β水平在第12天时显著升高(P<0.05)。结果表明牛源犬新孢子虫感染导致孕鼠胎盘激素和细胞因子的调节功能失衡,严重影响胎盘血流、胎盘物质转运及胎儿生长发育,将导致不良妊娠的发生。

犬新孢子虫NcSRS2基因原核表达质粒的构建

根据已发表的犬新孢子虫NcSRS2基因序列,设计1对含有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点的引物。以提取犬新孢子虫虫体基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得NcSRS2 ORF基因片段,将此基因片段克隆到pMD18-T Simple载体上,用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切该片段,回收得到含有两个酶切位点黏端的Nc-SRS2 ORF基因,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的PGEM-4T-2原核表达载体中,获得重组质粒pGEX-NcSRS2,经PCR鉴定,限制性内切酶分析和克隆片段序列测定比较,证实了重组质粒的正确性。

青海省乌兰县牧羊犬犬新孢子虫病的血清学调查

用犬新孢子虫的重组蛋白GST-NcSAG1t作为ELISA诊断抗原,对青海省乌兰县的部分牧羊犬进行了犬新孢子虫病的血清学调查。经过对所收集的80份牧羊犬血清的检测,共检出犬新孢子虫病阳性血清25份,阳性率为31.25%。结果表明青海省乌兰地区的牧羊犬中存在犬新孢子虫感染。

牛源犬新孢子虫NcSAG1基因重组腺病毒株的构建及动物免疫试验

【目的】构建表达牛源犬新孢子虫NcSAG1基因的重组腺病毒株,并接种Balb/c小鼠,评价重组腺病毒株对Balb/c小鼠的体液免疫和细胞免疫应答水平。【方法】PCR扩增牛源犬新孢子虫NcSAG1基因,构建pMD18-T-NcSAG1克隆质粒和pCR259-NcSAG1重组腺病毒穿梭质粒;将鉴定正确的pCR259-NcSAG1重组腺病毒穿梭质粒依次转化HighQ-1 Transpose-Ad 294和HighQ-1感受态细胞,构建Transpose-Ad-NcSAG1重组腺病毒表达质粒;PacI酶切线性化后,脂质体介导转染QBI-HEK 293细胞包装重组腺病毒Ad5-NcSAG1,应用PCR和Westernblotting技术检测Ad5-NcSAG1及其表达蛋白产物。测定Ad5-NcSAG1重组腺病毒滴度后,接种Balb/c小鼠,测定小鼠血清中IgG特异性抗体和细胞因子IFN-γ、IL-4水平,以此评价重组腺病毒株的免疫应答效果。【结果】扩增的牛源犬新孢子虫NcSAG1基因大小为982bp,与GenBank中发表的NcSAG1(AF132217)核苷酸序列的同源性为99.2%;经PCR和Western blotting检测,重组腺病毒Ad5-NcSAG1在QBI-HEK 293细胞中包装成功,表达蛋白的分子量为33kD,具有较好的反应原性;测得重组腺病毒Ad5-NcSAG1滴度为1010TCID50/mL,Ad5-NcSAG1接种Balb/c小鼠后,能够诱导产生高水平的IgG特异性抗体和IFN-γ、IL-4细胞因子。说明Ad5-NcSAG1重组腺病毒对Balb/c小鼠产生了较强的体液免疫和细胞免疫应答。【结论】成功构建了牛源犬新孢子虫NcSAG1基因的重组腺病毒株,该毒株能够诱导Balb/c小鼠产生高水平的体液免疫和细胞免疫应答,为犬新孢子虫新型疫苗的临床试验奠定了基础。

上海地区奶牛犬新孢子虫病血清学抗体检测

为了掌握上海地区奶牛新孢子虫病的流行情况，应用酶联免疫吸附试验对上海地区奶牛血清样品进行新孢子虫病抗体检测。结果表明，被检的41个奶牛场1239份奶牛血清中有63份抗体阳性，阳性率为5．08％。各场阳性率变幅较大（0-44．23％）。