新的犬ANP32A的克隆及其在流感病毒跨物种感染中的作用

物种特异的酸性核磷蛋白32A(acidic nuclear phosphoprotein 32A,ANP32A)调节不同宿主A型流感病毒RNA聚合酶活性。为分析犬ANP32A(canine ANP32A,caANP32A)的物种特异性及其在流感病毒跨物种感染中的作用,利用RT-PCR方法从MDCK细胞以及犬肺、脾、肠不同组织中扩增和克隆caANP32A;激光共聚焦试验分析caANP32A与A型流感病毒RNA聚合酶的相互作用;双荧光素酶报告基因试验检测过表达caANP32A对A型流感病毒RNA聚合酶活性的影响。结果显示,从MDCK细胞中扩增到新的caANP32A,比已报道的caANP32A多出4个氨基酸插入,从犬肺、脾和肠组织中均扩增到该新的caANP32A;对caANP32A的基因进行测序分析,发现该新的caANP32A不是由mRNA选择性剪接形成的;激光共聚焦试验发现,新caANP32A与H3N2 CIV的RNA聚合酶在细胞核中共定位;聚合酶活性试验显示,在哺乳动物细胞过表达新caANP32A不能促进H9N2禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)和H3N2犬流感病毒(canine influenza virus,CIV)的RNA聚合酶活性,而鸡ANP32A(chANP32A)能够促进。本研究克隆的新caANP32A较以往报道,在176至179位存在四个氨基酸LSLV的插入,但新caANP32A对AIV的RNA聚合酶活性仍然有物种限制性且该新的caANP32A也未增强CIV的RNA聚合酶活性。本研究为进一步解析犬在流感病毒跨物种感染中的作用提供依据。

犬流感病毒H_(3)N_(2)和H_(3)N_(8)亚型流行病学研究进展

自2004年首次在美国发现犬流感病毒(canine influenza virus,CIV)以来,经过不断的演变进化和跨物种的传播,CIV已在全球范围内广泛传播。由于犬对多种流感病毒易感,流感病毒对犬的影响及其产生人畜共患的大流行性流感的风险不容忽视。文章就CIV的病原学及较稳定传播的两种亚型CIV(H_(3)N_(2)和H_(3)N_(8))的流行病学进行综述,旨在为CIV的预防、诊断以及疫苗研发等提供参考。

高增殖性能犬流感CIV-PR8重组病毒的制备

为获得高效表达犬流感病毒(CIV)HA和NA抗原的疫苗株,本实验通过反向遗传操作技术将A/canine/Zhejiang/01/2010(H3N2)犬流感病毒(简称ZJCIV)的HA和NA基因与A/Puerto Rico/8/34(H1N1)病毒(PR8)的6个内部基因进行重组,拯救并获得了一株重组病毒CIV-PR8。分别用含100 EID50的CIV-PR8和ZJCIV感染SPF鸡胚,含2×103TCID50的CIV-PR8和ZJCIV感染MDCK细胞,不同时间段取病毒样品测定血凝效价和TCID50值。两者比较表明,CIV-PR8分别在接种后36 h和48 h时血凝效价达到峰值,鸡胚尿液中效价可达210,为野生病毒株的16倍;细胞上清血凝价可达28,为野生病毒株的4倍;病毒增殖曲线表明通过鸡胚扩增和细胞扩增,CIV-PR8的滴度均高于野生病毒株ZJCIV。结果表明,拯救的CIV-PR8增殖能力明显高于野生病毒株ZJCIV,该重组病毒有望成为犬流感疫苗研制的候选病毒株。

H3N2亚型犬流感病毒实验感染模型的建立

【目的】建立H3N2亚型犬流感病毒(canine influenza virus,CIV)实验感染模型,了解犬流感的发病特征,为疫苗效力评价奠定基础。【方法】6—13月龄CIV血凝抑制(haemagglutination inhibition,HI)抗体阴性(HI<1﹕10)比格犬26只,其中3只鼻腔喷雾PBS作为阴性对照,另23只分5组(10、103、105、106、107 EID50/只),分别为3、5、5、5、5只/组,每只犬各鼻腔喷雾H3N2亚型CIV(A/canine/China/Huabei-170607/2017(H3N2),简称HB株)病毒液1mL。观察临床症状、肺脏病变和肺脏组织病理学变化,计算肺实变率,检测病毒和HI抗体效价。【结果】10 EID50剂量感染组,3只犬均未出现明显临床症状,肺脏均无明显眼观病变,肺脏实变率0%,无组织病理学变化,病毒检测均为阴性,HI抗体效价几何平均值(geometric mean titer,GMT)为1﹕15.9;103 EID50剂量感染组,5只犬中有4只喘息、流鼻汁和咳嗽,1只犬未表现出临床症状,2只犬肺脏出现轻微实变,实变率平均为1.4%,4只犬病毒分离阳性,HI抗体效价GMT为1﹕320;105 EID50剂量感染组,5只犬在攻毒后5 d开始出现流鼻汁和咳嗽等临床症状,肺脏均有实变,实变率平均为4.2%,肺泡间隔增宽,病毒分离均为阳性,HI抗体效价GMT为1﹕2940.7;106 EID50剂量感染组,5只犬在攻毒后4 d体温升高、流鼻汁、咳嗽,临床症状出现较105 EID50剂量感染组早1 d,肺脏实变程度增加,实变率平均为17.9%,肺泡间隔增宽,病毒分离均为阳性,HI抗体效价GMT为1﹕2228.7;107 EID50剂量感染组,5只犬在攻毒后3 d表现出体温升高、流鼻汁、咳嗽等严重的临床症状,症状出现较106 EID50剂量感染组早1 d,肺脏严重实变,实变率平均为29.0%,肺泡间隔增宽,病毒分离均为阳性,HI抗体效价GMT为1﹕2940.7;对照犬均未出现明显临床症状,肺脏均无明显眼观病变,无组织病理学变化,病毒检测均为阴性,HI抗体效价均<1﹕10。【结论】106 EID50剂量病毒是能引起犬明显发病的最小病毒接种剂量,建立起H3N2亚型CIV实验感染模型。

富硒乳酸菌对犬流感病毒诱导小鼠肺损伤的保护作用

为研究富硒乳酸菌(SL)对犬流感病毒(CIV)感染诱导肺损伤的保护作用,选取90只6~7周龄的C57BL/6小鼠,随机分为对照组,CIV感染组(CIV组),CIV+乳酸菌组(CIV+L组),CIV+亚硒酸钠组(CIV+SS组)和CIV+富硒乳酸菌组(CIV+SL组),每组3个重复,每个重复6只小鼠。各组分别饲喂上述不同日粮,1周后除对照组外,其他各组均用H3N2亚型CIV毒株(JS/10)滴鼻,攻毒后1周解剖各组小鼠,取肺组织,计算肺指数,观察肺组织形态结构,HE染色检测肺组织病理变化,检测肺组织中病毒含量,检测抗氧化指标。结果显示:CIV感染后肺指数显著升高(P<0.05),肺组织水肿和出血,炎性细胞浸润,肺泡间隔增厚;肺组织检测到病毒M mRNA及NP蛋白;肺脏中超氧化物歧化酶(SOD)活性和总抗氧化能力(T-AOC)水平降低(P<0.05),丙二醛(MDA)含量升高(P<0.05)。与CIV组相比,CIV+L组、CIV+SS组和CIV+SL组肺指数显著降低(P<0.05),肺组织病变程度减轻,炎性细胞浸润明显减轻,肺泡间隔增厚减少;肺组织病毒M mRNA及NP蛋白水平显著降低(P<0.05);肺脏中SOD活性和T-AOC水平显著升高(P<0.05),MDA含量降低(P<0.05)。CIV+SL组与CIV+L和CIV+SS组相比,CIV+SL组肺指数显著降低(P<0.05),CIV+L和CIV+SS组表现为中等程度的的水肿和出血、炎性细胞浸润和肺泡间隔增厚;肺组织病毒M mRNA及NP蛋白水平显著降低(P<0.05);肺脏中SOD活性和T-AOC水平显著升高(P<0.05),MDA含量降低(P<0.05)。综上,富硒乳酸菌对H3N2亚型CIV感染引起的肺损伤具有较好的保护作用,其作用可能与抑制病毒感染与提高抗氧化能力有关。

2020—2022年华中地区犬副流感病毒检测及其F、HN基因系统发育分析

为探究华中地区犬副流感病毒(CPIV)的流行及遗传进化情况,利用RT-PCR方法对华中地区2020年9月—2022年1月收集的418份病料样品进行了CPIV检测,并利用生物信息学软件对分离的CPIV毒株的F、HN基因进行同源性、氨基酸位点分析及系统发育分析。结果显示:CPIV阳性率为15.8%,扩增获得9株CPIV的F、HN基因的序列,并成功分离培养9株CPIV毒株;同时,将分离株的F、HN基因与19株副流感病毒参考毒株进行序列比对分析,结果表明,F基因核苷酸同源性为95.1%~100%,氨基酸同源性为94.6%~99.8%,HN基因核苷酸同源性为95.9%~99.9%,氨基酸同源性为95.8%~99.6%;CPIV的F及HN基因与参考毒株相比均有部分氨基酸发生了突变;系统发育分析结果显示,本研究获得的8株分离株与美国株CPI-和CPI+处于同一分支上,亲缘关系较近,另一株分离株CS-324与中国株He N0718和韩国株D277位于同一分支上。本研究丰富了华中地区CPIV的流行病学调查资料,并为该病的综合防控提供了理论依据。

犬流感病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

为了建立一种便捷、灵敏的犬流感病毒(CIV)检测技术,本研究根据CIV相对保守的M片段设计3对特异性引物,建立CIV的RT-LAMP检测方法,对反应体系中的MgSO4、Betaine、Bst DNA PoLymerase、dNTP、引物浓度等分别进行了优化,并进行敏感性和特异性试验。结果表明:所建立的反应体系在恒温水浴锅中作用45min即可得到其特有的阶梯状条带,而且对犬细小病毒、犬瘟病毒和犬副流感病毒的扩增结果均为阴性。该方法对CIV RNA的最小检测限为0.1pg,灵敏性高于一步RT-PCR方法。RT-LAMP和普通RT-PCR方法检测临床样品的符合率为93.02%。该方法为犬流感病毒的临床检测提供了一种简便、实用的方法,为基层检疫提供了方便。

麻杏石甘汤对A型流感病毒感染的犬肾传代细胞凋亡的影响

目的:探讨麻杏石甘汤对A型流感病毒感染的犬肾传代(MDCK)细胞凋亡的影响。方法:运用原位末端标记技术和流式细胞术分别检测最大无毒限量的麻杏石甘汤对A型流感病毒感染的MDCK细胞凋亡百分率与细胞周期变化的影响。结果:麻杏石甘汤能显著降低A型流感病毒感染的MDCK细胞的凋亡百分率,下调其G1/G0期细胞比例,上调其S期、G2/M期细胞比例以及细胞增殖指数(PI)值。结论:麻杏石甘汤通过调整流感病毒感染的MDCK细胞的细胞周期,降低细胞凋亡百分率而发挥抗流感病毒作用。

类人H3N2犬流感病毒广西分离株的鉴定及其遗传演化分析

为了解广西各地区宠物犬流感病毒（CIV）的流行情况,本研究从9个地级市宠物医院采集了326份犬鼻拭子样品,经RT-PCR检测为CIV阳性后对其进行MDCK细胞分离病毒,并对分离株进行全基因组测序和序列分析。结果表明获得2株CIVs分离株,均属于人源谱系,与Moscow/10/99（H3N2）人流感病毒株的同源性大于99%。8个基因节段的核苷酸序列遗传演化分析显示,这2株CIVs与人源H3N2亚型猪流感病毒（SIV）最为相近,同在Moscow/99分支。HA1蛋白氨基酸位点分析显示aa190~aa196位点处仍保留SIV的受体相关结合位点（DQISVYA）,但却改变了流行于人类的部分受体结合位点（DQTSLYT）。本研究为有效预防人-犬流感病毒传播提供了实验依据。

H3N2亚型犬流感病毒的分离鉴定

为了解广州地区犬流感的流行情况,本研究采集107份犬鼻咽拭子样品和58份血清样品,SPF鸡胚分离病毒并进行抗体检测。结果显示:分离获得3株H3N2亚型犬流感病毒。分离株的EID50为10-2.42/0.1 mL～10-3.5/0.1 mL;MDT为177.6 h～192 h;对乙醚、氯仿、酸和温度均敏感;对血凝素为热不稳定型;能够凝集公鸡、豚鼠、猪和牛的红细胞。

核酸水平检测犬副流感病毒方法的建立

根据GenBank中与犬副流感(CPIV)同源性较近的SV5病毒N基因保守序列,利用DNAStar软件设计了一对特异性引物,能扩增265bp大小的片段,并以此建立了检测CPIV的RT-PCR方法,实验证明该对引物特异扩增CPIV;不扩增犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒和狂犬病病毒犬的四种病原的核酸。检测临床病料20份,其中2分为CPIV阳性。此法敏感性较高。是检测犬急性传染性呼吸道疾病(CIRD)中CPIV的有效的方法。

虎血清中犬副流感病毒的抗体流行病学调查研究

为查明犬副流感病毒 (CPIV)对虎的感染情况 ,应用CPIV细胞培养物为血凝抑制 (HI)抗原 ,对上海、桂林、哈尔滨、宜昌、郑州等地区未曾使用过任何含CPIV疫苗免疫的 38只虎的血清进行HI抗体检测。结果表明 ,有 2 5份血清CPIV的HI抗体效价为 1∶4～ 1∶32 ,有 1 3份抗体效价 <1∶2 ,血清中CPIV的HI抗体阳性率达 65 79%。

甲流重组犬流感病毒的小鼠致病性研究

本研究通过建立犬流感病毒(Canine influenza virus,CIV)感染BALB/c小鼠模型,探索新发现的甲流重组CIVs对小鼠的致病性。我们采用9株H1N1和1株H3N2甲流重组CIVs,以106 TCID_(50)/mL的剂量滴鼻攻毒10组小鼠。结果表明:感染后4 d小鼠体重均有一定程度的下降,其中A/Canine/Guangxi/LZ56/2015(H1N1)(简称LZ56)组的小鼠体重下降最为明显(P<0.5),其存活率为77.78%;通过TCID_(50)测定发现10株甲流重组CIVs均能在小鼠的鼻窦和肺脏复制,以LZ56组的复制滴度最高,分别达到107.3 TCID_(50)/mL和10^(5.3) TCID_(50)/mL;肺脏病理切片观察发现LZ36、LZ45、LZ56和QZ5组出现不同程度病变,以支气管上皮细胞坏死脱落,肺泡壁增厚,肺泡腔以及支气管内有大量的弥漫性浸润的单核细胞为主要特征。结果表明,新型重组CIVs均能感染BALB/c小鼠,并能在小鼠体内较好复制,甚至致死,一旦这些新型CIVs以犬为中间宿主传播给人,势必对人类健康构成重大威胁。因此,加强对CIVs的监测将为防控人流感大暴发提供提前预警。

H3N2亚型犬流感病毒HA1基因的原核表达及抗原性分析

为原核表达H3N2亚型犬流感病毒(CIV)HA1蛋白,本研究利用特异性引物扩增CIV H3分离株的HA1基因,将其克隆到pMD18-T载体后进行序列测定。再将其亚克隆于pET-32a(+)中构建重组表达质粒pET-HA1。将该质粒转化于大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析,表达的重组蛋白约为58 ku。纯化的HA1蛋白经western blot和Dot-ELISA鉴定表明,表达的重组HA1蛋白可以与H3N2亚型CIV阳性血清发生特异性反应。

犬副流感病毒单克隆抗体的研制及其特性鉴定

为研制犬副流感特异性诊断试剂,我们以犬副流感病毒(CPIV)免疫8周龄BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术获得4株稳定分泌针对CPIV的单克隆抗体(MAb)细胞株,分别命名为4F3B6、5B4C9、4G7F4和4C9D8。4株MAb腹水针对CPIV的间接ELISA抗体效价达1:105～1:106,与犬瘟热病毒(CDV)和犬细小病毒(CPV)均不发生交叉反应。MAb4F3B6和4C9D8为IgG,5B4C9和4G7F4为IgM。Western blot检测表明,4F3B6与CPIV的F蛋白发生特异性反应,4G7F4与CPIV的HN蛋白发生特异性反应,而5B4C9和4C9D8不与变性的CPIV蛋白发生反应。4株MAb均具有中和病毒活性,间接免疫荧光检测均呈为阳性。本研究为进一步研制CPIV特异性诊断和治疗制剂创造了条件。

一株H3N2亚型犬流感病毒的分离与进化分析

2012年从南京市某宠物医院采集的20份犬鼻拭子中分离到1株犬流感病毒（Canine influenza virus,CIV）,命名为A/Canine/Nanjing/11/2012（H3N2）.该病毒分离株的血凝素（hemagglutinin,HA）效价为28,鸡胚半数感染量（median embryoinfective dose,EID50）和最小致死量平均死亡时间（mean death time,MDT）分别为10-7.60/0.1 mL和69.6h/10-4.血凝素（HA）基因、神经氨酸酶（neuraminidase,NA）基因和核蛋白（necleoprotein,NP）基因的系统发育进化树均显示该分离株CIV位于禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）亚群中,并与H3N2亚型CIV辽宁分离株和黑龙江分离株位于同一分支上,具有最近的亲缘关系（HA基因的同源性为99.5％～99.6％,NA基因的同源性为99.0％～99.2％,NP基因的同源性为99.1％～99.3％）.氨基酸序列分析显示,该病毒分离株与其他犬流感病毒分离株的HA、NA和NP氨基酸序列存在个别位点的突变.

犬副流感病毒NP基因的克隆与原核表达

以犬副流感病毒RNA为模板,采用RT-PCR方法,连接pMD18-T载体获取NP蛋白编码基因核苷酸序列,并应用定向克隆技术,构建原核表达载体pGEX-6P-1-NP。经测序鉴定证实获取的NP蛋白核苷酸序列与GeneBank中标准序列存在两处碱基变异,导致编码的蛋白质出现一个氨基酸的变异。测序结果表明,克隆出的目的基因序列已定向克隆到pGEX-6P-1载体,成功构建了其原核表达载体,并能在大肠杆菌BL21(DE3)中得到表达。Westen-Blotting分析结果显示,表达的GST-pGEX-6P-1-NP重组融合蛋白为82.1 kDa,可被犬副流感阳性血清所识别,表明NP基因所编码的蛋白具有一定的免疫活性。

H3N2亚型犬流感病毒NP蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备

将分离的H3N2亚型犬流感病毒(Canine influenza virus,CIV)A/Canine/Nanjing/11/2012(H3N2)株的核蛋白(NP)基因克隆至原核表达载体p ET28a(+)中,构建重组表达质粒p ET-NP,然后转化大肠杆菌E.coli Rosetta(DE)感受态细胞,经IPTG诱导后,采用SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果显示,大肠杆菌表达的重组NP蛋白的分子量约为61 k Da,与预期相符,并能与犬CIV阳性血清发生特异性反应。将表达的重组NP蛋白进行纯化后,免疫大白兔制备抗NP蛋白多克隆抗体血清,Western blot检测该血清可与CIV的NP蛋白发生特异性反应,间接ELISA检测该多克隆抗体血清的效价达1:30 000,显示了较高的抗体效价。本研究为CIV快速检测方法的建立和流行病学调查奠定了科学依据。

H3N2亚型犬流感病毒血凝及血凝抑制试验的研究

为优化H3N2亚型犬流感病毒(CIV)的血凝抑制(HI)试验方法,本研究应用不同种类红细胞进行CIV的血凝(HA)试验,应用不同种类红细胞和不同血清处理方法进行CIV的HI试验,评价其对HA和HI试验的影响。结果表明,H3N2亚型CIV对鸡和犬红细胞的凝集性最好,对小鼠、猪和牛红细胞的凝集性较差。HI试验应用鸡红细胞悬液效果最好,受体破坏酶(RDE)和高碘酸钾处理可以有效去除犬血清中非特异血凝抑制素,但高碘酸钾对血清特异性抗体有损耗。本研究筛选出H3N2亚型CIV HI试验的最佳方法,为犬流感的血清学诊断提供技术支持。