基于RPA-CRISPR/Cas12a技术快速检测犬猫皮肤癣菌方法的建立

旨在建立重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)结合CRISPR/Cas12a技术的荧光检测方法,以快速、灵敏、可视化检测犬猫皮肤癣菌。以犬小孢子菌、石膏样小孢子菌及须毛癣菌为研究对象,针对真菌内转录间隔区,设计并合成特异性RPA引物和CRISPR RNA(crRNA),建立可同时或分别检测上述皮肤癣菌的荧光检测方法,并评价其检测灵敏度,通过检测临床样本评价本检测方法的敏感性和特异性。结果表明:RPA-CRISPR/Cas12a在37℃、总反应时间30 min的条件下,对三种皮肤癣菌的检测灵敏度可低至单拷贝。对24份临床样本进行检测,以真菌培养和菌落测序结果作为标准,使用可同时识别犬小孢子菌、石膏样小孢子菌及须毛癣菌的皮肤癣菌crRNA(dermatophyte crRNA,crRNA-DM)和可特异性识别犬小孢子菌的犬小孢子菌crRNA(Microsporum canis crRNA,crRNA-Mc)参与RPA-CRISPR/Cas12a反应时,敏感性和特异性均为100%。RPA-CRISPR/Cas12a技术可同时和分别检测犬小孢子菌、石膏样小孢子菌及须毛癣菌,所需时间短,结果可视化,敏感性和特异性高,无需昂贵仪器,适合临床快速诊断。