一株犬种布鲁氏菌的分离鉴定及其在巨噬细胞内存活能力的研究

为分离鉴定流产犬的致病病原及其生物学特性,本研究从重庆某宠物医院无菌采集流产犬全血2份,将其涂布于布鲁氏菌选择培养基,分别在不含CO_(2)和含7.5%CO_(2)条件下37℃培养72 h,观察菌落形态,并经结晶紫染色,观察细菌类型。按照国家标准鉴定分离菌的生化特性。细菌分离结果显示,在不含CO_(2)和含7.5%CO_(2)的培养箱中2份流产犬全血样品在布鲁氏菌选择培养基上均长出边缘整齐、光滑的圆形菌落,透射光下,菌落呈浅黄色且有光泽;结晶紫染色结果显示分离菌为典型的粗糙型细菌;生化鉴定结果显示,分离株在TSA中的生长不依赖于CO_(2),且不产生H2S,氧化酶和脲酶试验均为强阳性。上述结果表明分离到一株犬种布鲁氏菌,命名为B. canis CQ3。对分离菌进行全基因组测序,利用MAUVE对分离株与GenBank中38株不同种的布鲁氏菌基因组进行比对,并构建分离菌全基因组的进化树。将不同种布鲁氏菌及分离株分别接种于TSB培养基中,通过测定不同时间的OD450nm值绘制各菌株的生长曲线。将各菌株及B. canis CQ3株分别以MOI 100感染小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7,在感染后的不同时间(1 h、24 h、48 h和72 h)收集细胞,经相应处理后涂布TSA平板培养72 h后,经菌落计数分析分离菌株在细胞中的存活能力。全基因组序列比对及进化树结果显示,比对到犬种布鲁氏菌的序列数量最多,且B. canis CQ3株与欧洲分离的犬种布鲁氏菌NR-finland株的亲缘关系最近。生长曲线测定结果显示,在6 h~16 h (对数生长期) B. canis CQ3株的生长速度稍快于羊种布鲁氏菌B. melitensis XJ流行株和牛种布鲁氏菌B. abortus DT流行株;整个生长过程中B. canis CQ3株的生长速度与疫苗株A19和S2基本一致。巨噬细胞感染试验结果显示,感染1 h时,B. canis CQ3株进入巨噬细胞数量多于疫苗株A19和S2、B. melitensis XJ和B. abortus DT株。相比B. melitensis XJ和B. abortus DT株,B. canis CQ3株在胞内的活菌数均有所降低(感染后24 h)和极显著降低(感染后48 h)(P<0.001),但一直与疫苗株A19和S2在胞内的的活菌数相当。相比于感染后24 h,感染后48 h B. canis CQ3株的胞内活菌数升高了近10倍。上述结果表明,本研究分离鉴定的B. canis CQ3株的体外生长特性与疫苗株A19和S2基本一致,但在对数期的生长稍快于B. melitensis XJ株和B. abortus DT株,且其在RAW264.7细胞中的存活能力较好。本研究首次系统比较了犬种布鲁氏菌分离株与疫苗株A19、S2以及牛羊布鲁氏菌流行株在鼠源巨噬细胞中的存活能力,为进一步开展犬种布鲁氏菌病原学和流行病学调查提供了参考依据。

一株犬种布鲁氏菌的分离与鉴定

对从一只流产贵宾犬全血中分离到的一株布鲁氏菌进行了形态结构、培养特性、生化特性研究以及凝集试验鉴定和多种属聚合酶链式反应(AMOS-PCR)鉴定。结果表明,分离菌为革兰氏阴性菌,在胰眎琼脂培养基生长并呈典型的粗糙型布鲁氏菌菌落,菌落能被结晶紫溶液染成紫色。分离菌在琉瑾和复红培养基上生长,不产生H2S,与粗糙型布鲁氏菌阳性血清凝集,与光滑型布鲁氏菌阳性血清无凝集。用AMOS-PCR方法对分离菌进行鉴定,该分离菌具有犬种布鲁氏菌特有条带。鉴定结果表明分离菌符合犬种布鲁氏菌特性,将其命名为B.canis GB1。

1例结石患犬尿液中犬种布鲁氏菌的分离与鉴定

本试验从1例因膀胱尿道结石而行膀胱切开术和公犬去势术患犬的膀胱中采集尿液,进行常规细菌分离培养,获得1株生长缓慢的革兰阴性细菌,经飞行质谱鉴定、16S rDNA序列分析,确定分离菌株为布鲁氏菌属细菌;经布鲁氏菌Ladder-PCR鉴定,进一步确定该分离菌株为犬种布鲁氏菌。于术后14 d和60 d再次膀胱穿刺法采集患犬尿液进行细菌分离,获得的细菌经鉴定仍为犬种布鲁氏菌,且随着时间增长细菌数量呈递增趋势。本试验结果提示,犬种布鲁氏菌可能为犬膀胱结石的致病因子,且经尿液排泄对环境造成的污染具有重大公共安全隐患。

一株犬种布鲁氏菌的鉴定及毒力测定

对分离到的一株疑似犬种布鲁氏菌进行生物特性和基因型鉴定,并用宿主实验动物(比格犬)测定了最小感染量和脾含菌量。形态与染色特性、培养特性、血清学特性、生化特性鉴定以及Multi-PCR和16S rRNA测序结果表明,该分离株为犬种布鲁氏菌,其对比格犬的最小感染剂量为10~5 CFU/m L,对应的脾含菌量为4×10~5~3×10~6 CFU/g。

犬种布鲁氏菌研究进展

犬种布鲁氏菌属于6个经典种布鲁氏菌之一,为天然粗糙型,毒力较弱。长期以来,由于犬种布鲁氏菌对人类致病性较低,其危害一直被忽视。自1966年在美国发现该菌以来,已传播至世界多地。近年来,随着养犬业的不断发展及宠物犬数量的增多,犬布鲁氏菌病发病率不断上升,在某些地区已成为流行性疫病,且对人类公共卫生安全的威胁也日益加重。目前,犬种布鲁氏菌感染导致的犬布鲁氏菌病尚无可靠的诊断方法及有效的疫苗。鉴于此,在查阅相关文献的基础上,笔者对犬种布鲁氏菌的病原学、流行病学、致病机理、检测方法、疫苗研究等方面的相关研究进展进行综述,以期为犬布鲁氏菌病的深入研究和防控提供参考。

辽宁省首次发现犬种布鲁氏菌病的报告

辽宁省1988年对10个市的48个县(区)50个乡(镇)92个村(屯)中的1555只家犬做了犬种布鲁氏菌感染情况调查。在其中6个县(区)共查出血清阳性犬29只。检测接触阳性犬的人血清90份,阳性1份,疑似12份。在18只血清阳性犬的脏器中培养分离出犬种布鲁氏菌14株。首次证实辽宁省存在犬种布鲁氏菌病疫源地。

虎红平板凝集试验在犬种布鲁氏菌病调查中的应用

用犬种布鲁氏菌制备虎红平板凝集试验粗糙型抗原进行犬种布鲁氏菌病调查,并采用虎红平板凝集定量试验以及2-ME和葡萄球菌甲蛋白(SPA)处理血清后试验的方法,初步探讨了虎红平板集试验在犬种布鲁氏菌病调查中的用价值。

宠物犬的犬种布鲁氏菌病的诊断和治疗方法探讨

布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌属细菌引起的人兽共患的常见传染病。犬种布鲁氏菌(B.canis)是布鲁氏菌属的一个种,其危害程度略低于羊、牛和猪种布鲁氏菌,主要感染犬,也可以感染猪、牛、羊等动物,对人的感染鲜有报道,但国内1980~1996年曾有人感染的案例[1,2,3],潜在的公共卫生意义较大。

广西犬种布鲁氏菌毒力测定

为证实我区分离的犬种布氏菌的致病性，我们根据菌株的抗原性、药敏试验及地区分布，选出毒力较强的有代表性的广西株，同时与ＲＭ６／６６参考株分别接种小白鼠和做青霉素毒力测定，小白鼠经皮下接种后，第７天处死解剖，所有脏器均分离出菌。两株广西株在含１０ＩＵ／ｍｌ的青霉素培养基上仍可生长。而ＲＭ６／６６参考株能生长的最高浓度为５ＩＵ／ｍｌ。

桂林地区犬种布鲁氏菌病的调查

自1985年首次从本地区农村家狗中分离出犬种布鲁氏菌(B·canis)后,我们继续开展犬种布鲁氏菌病的调查研究,现将结果报告如下。 材料与方法 一、调查对象 本地区各县农村居民喂养的家狗、与狗密切接触者。 二、抗原及诊断制剂 B.canis抗原,A、M。

基于不同抗原的犬布鲁氏菌病免疫层析胶体金抗体试纸条的制备和比较

为建立针对犬布鲁氏菌病的免疫层析胶体金快速检测方法,利用从犬种布鲁氏菌菌株提纯的膜蛋白和可溶性蛋白,原核表达纯化的外膜蛋白Omp31和BP26以及基于B细胞抗原肽的融合蛋白F14,分别制备了试纸条,然后采用犬布鲁氏菌病阳性和阴性血清,分别对上述试纸条进行敏感性和特异性比较。结果显示:Omp31抗原的敏感性最高,其次是F14和BP26,而全菌膜蛋白和全菌可溶性蛋白的敏感性较差;特异性上,使用由5种抗原制备的胶体金试纸条检测30份犬布鲁氏菌病阴性血清,结果均为阴性;5种试纸条与沙门氏菌、大肠杆菌(O157)、大肠杆菌(H7)、霍乱弧菌、副溶血弧菌、军团菌阳性血清均不发生交叉反应。另外,由F14和BP26制备的试纸条可识别羊布鲁氏菌病阳性血清,而由Omp31、全菌膜蛋白和全菌可溶性蛋白制备的试纸条均不能识别牛、羊布鲁氏菌病阳性血清。综上所述,Omp31、F14和BP26可作为制备犬布鲁氏菌病免疫层析胶体金检测卡的备选抗原。本研究为粗糙型布鲁氏菌引起的布鲁氏菌病的诊断提供了技术支撑。

犬种布鲁氏菌的遗传多样性分析

【背景】犬种布鲁氏菌是犬种布病的病原菌,主要导致犬流产和繁殖障碍。虽然犬种布鲁氏菌感染人群的病例极为少见,但是犬种布鲁氏菌对人的安全风险仍存在争议。目前,我国犬种布病的流行病学特征及犬种布鲁氏菌的遗传多样性的研究相对缺乏。开展犬种布病的流行特征及遗传多样性调查对加强犬种布病的监测防控具有重要意义。【目的】对犬种布病的流行病学特征和犬种布鲁氏菌的遗传多态性进行调查,为犬种布病的防控提供参考。【方法】采用常规鉴定方法和BCSS-PCR对63株试验菌株进行鉴定。采用HGDI (Hunter and Gaston diversity index)多态性指数调查犬种布鲁氏菌的遗传多态性,用MLVA方法基于BioNumerics5.0软件对菌株进行聚类分析,揭示犬种布病的流行病学特点。此外,基于MLVA-11采用goeBURST软件构建犬种布鲁氏菌的最小生成树(Minimum spanning tree,MST),阐述我国犬种布鲁氏菌的地理起源特征。【结果】常规鉴定方法和BCSS-PCR扩增结果显示63株试验菌株全部为犬种布鲁氏菌。BCSS-PCR与常规鉴定方法的符合率为100%,BCSS-PCR的分析敏感性为10^-3 (即50 pg/μL犬种布鲁氏菌DNA)。我国犬种布鲁氏菌具有较高的遗传多样性,基于HGDI分析表明Panel 2B的5个位点具有较高的变异度,等位基因型由高到底依次为bruce09(11)> bruce07(8)>bruce16(7)>bruce04(6)>bruce30(5)。MLVA聚类分析表明北京地区出现了3次较小规模的犬种布病暴发流行,其余地区均为零星散发。我国犬种布鲁氏菌可分为5个地理集群,以MLVA-11基因26型克隆群为主导种群,该种群与来自美国、希腊、加拿大、法国、罗马尼亚和韩国等国家的菌株具有共同的地理起源,其余4个种群为中国特有。【结论】我国犬种布鲁氏菌呈现高度的遗传多样性并有广泛的地理来源,表现为输入性和中国特有血统共存的起源进化特征。

辽宁省1株犬种布鲁氏菌分离株的分子生物学鉴定

目的对2010年辽宁省分离的1株疑似犬种布鲁氏菌进行生物型及分子生物学鉴定。方法采用布鲁氏菌常规鉴定分型方法,结合多重聚合酶链反应(PCR)和多位点可变数量串联重复序列分析(MLVA)方法。结果常规分型方法和MLVA方法鉴定该分离株为犬种布鲁氏菌。结论采用传统分型方法,同时结合MLVA方法对布鲁氏菌进行分型鉴定,可以增加鉴定工作的稳定性与正确性。但多重PCR结果也提示犬种布鲁氏菌与猪种布鲁氏菌的亲缘关系较近。

犬种布鲁氏菌ZG株单克隆抗体4H3抗原模拟表位的筛选及分析

【背景】目前犬布鲁氏菌病诊断存在一定的困难。【目的】筛选并研究犬种布鲁氏菌单克隆抗体4H3株的特异性抗原表位。【方法】利用噬菌体肽库展示技术,以犬种布鲁氏菌单克隆抗体4H3株作为靶分子,包被酶标板,用12肽随机肽库经过3轮生物淘洗程序进行筛选。经过3轮筛选后,噬菌体产出率从5.00×10^(−7)增加到9.84×10^(−6),假阳性率逐轮降低。从第3轮筛选的阳性克隆中随机挑取14个进行增殖,提取基因组DNA,进行测序分析;并通过iELISA和cELISA检测阳性克隆的亲和性和特异性。【结果】14株阳性单克隆噬菌体共出现3种不同的短肽序列,分别是KMSIRHPIRLPI、ILRRRRKRIIQI和QRIHMRLTTQS;iELISA结果表明3种短肽序列与单克隆抗体的亲和性依次为KMSIRHPIRLPI>ILRRRRKRIIQI>QRIHMRLTTQS;cELISA结果显示短肽KMSIRHPIRLPI和ILRRRRKRIIQI特异性较强。对亲和性较强、特异性较高的2条短肽KMSIRHPIRLPI和ILRRRRKRIIQI展开具体分析,比对分析表明KMSIRHPIRLPI与犬种布鲁氏菌RM6/66菌株的肽酶C26家族蛋白(PuuD)有比较高的相似性,氨基酸符合率为75%,而且存在4位连续相似氨基酸;ILRRRRKRIIQI与布鲁氏菌6/66菌株中3-氧酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(OAR)相似性较高,氨基酸符合率为75%,存在2位连续相似氨基酸。【结论】利用噬菌体肽库展示技术筛选出与犬种布鲁氏菌ZG分离株单克隆抗体特异性结合的短肽序列。

北京地区宠物犬布鲁氏菌的分离与鉴定

自2012年11月至2013年6月,本实验室对北京市某动物医院送检的疑似患布鲁氏菌病宠物犬的38份血清进行抗体检测,22份阴道分泌物和2份抗凝血进行细菌分离。结果显示,18只宠物犬抗体检测为阳性,并且从5只抗体阳性的宠物犬体内还各分离到一株布鲁氏菌,其中4株为犬种布鲁氏菌,另一株生物型尚待确定。通过调查及临床症状的观察,推测病犬排泄物、流产物或者与病犬交配等可能导致布鲁氏菌病的传播,这为北京市宠物犬布病的流行性调查提供了一定的数据支持。

犬种布病与公共安全风险

布鲁氏菌包括12个已知的种型,其中牛、羊和猪种布鲁氏菌是已知的人兽共患病病原菌,引起人类较严重的感染发病。犬种布鲁氏菌主要导致犬流产和繁殖失败。虽然该菌感染人群的病例较为少见,但仍是一种潜在的威胁人类健康和动物福利的风险因素。因此,本文对犬种布鲁氏菌的病原生物学特性、致病性、流行病学、临床特征、治疗及对公众健康的影响等进行综述,为我国犬种布病的监测和防控提供参考依据。

2001-2015年锦州市布鲁氏菌病疫情流行病学分析

目的描述2001-2015年锦州市布病疫情流行病学特征和变化趋势,探讨下一步的防控重点。方法用描述流行病学方法对锦州市布病疫情进行分析,对试管凝集试验阳性率与发病率进行Pearson相关性分析。结果 2001-2015年锦州市布病发病率为0.45/10万-16.53/10万。发病时间集中在3-7月,占总数的66.89%。2003-2015年共采集重点人群血清5 904份,阳性率为5.01%。2007-2015年从136份血培养标本中分离出布鲁氏菌63株,其中羊种3型48株、羊种1型12株,羊种变异2株、犬种1株。结论锦州市近年布病疫情呈明显上升趋势,其优势菌株主要是羊种3型。对犬的布鲁氏菌携带情况应予以一定的关注,及时淘汰病犬。

试论动物布鲁氏菌病净化策略

据山东省疾病预防控制中心数据统计显示,2021年以来,山东省布鲁氏菌病(以下简称为“布病”)人间病例呈现明显的抬头趋势。2021年1月份发病病例数为120例,2021年2月份达到263例,疫情来势迅猛,且分布较广^([1])。众所周知,人间布病病例的感染几乎都来源于动物布病病例,其中羊种布鲁氏菌对人致病性最强,牛种、猪种和犬种布鲁氏菌也会感染人从而导致发病,因此,要遏制人间布病,就需从源头畜间进行布病净化和消灭,这项工作已迫在眉睫。