犬细小病毒层析纯化方法的建立

病毒纯度是抗体制备和疫苗免疫效果提升的关键,本文利用Purose shell V15离子交换层析和Sepharose 4FF分子筛层析分别建立了犬细小病毒(CPV)的纯化方法。将CPV经过离心澄清和膜包浓缩后,用AKTA蛋白纯化仪结合Purose shell V15和Sepharose 4FF分别进行纯化,最后使用超滤管浓缩,通过病毒含量测定、总蛋白回收率测定、SDS-PAGE、Western blot和电镜观察分析病毒的纯化效果。结果:2种方法纯化后病毒形态典型,病毒颗粒大小约20 nm,总蛋白去除率97%以上,回收率71%以上;Purose shell V15纯化后的病毒经SDS-PAGE和Western blot分析显示无细胞成分的杂带,而Sepharose 4FF纯化后的病毒有少量的牛血清白蛋白条带。本试验结果表明这2种方法均可用于CPV的纯化,Purose shell V15纯化后的病毒纯度更高。

犬细小病毒CPV-2c型亚洲株分离鉴定及VP2基因序列分析

为探明北京某犬场犬的死亡原因,从患有肠道出血的犬肛拭子中分离出1株犬细小病毒,试验通过PCR、血凝和间接免疫荧光试验方法对毒株进行鉴定,并对VP2基因进行克隆测序和序列分析,确定其遗传分支。结果表明,该分离株属于犬细小病毒CPV-2c型,命名为CPV-BJ21株。应用犬细小病毒单克隆抗体进行间接免疫荧光检测,结果为阳性;基因序列分析表明,分离株与犬细小病毒为同一进化分支,VP2基因核苷酸序列与中国四川的CPV-2c(MH476581.1)同源性达99%,与亚洲分离的犬细小病毒之间亲缘关系较近。VP2氨基酸序列在第A5G、S297A、D426E位出现了氨基酸突变;在F81细胞上传3代后,病毒液的血凝效价稳定于210。本研究可为犬细小病毒的流行情况及新疫苗的研究提供参考依据。

浅谈宠物犬细小病毒病的病因及综合防治

现阶段,饲养宠物犬已成为人们喜闻乐见的一种时尚与生活方式。作为陪伴动物,宠物犬能够为主人提供特殊的情感支持与生活保障。但是,在其生长发育过程中,绝大部分宠物犬难以避免地会发生各类疾病。因此,宠物犬饲养者应把犬类疾病的科学应对视为必修课。基于此,有必要将细小病毒病这一典型、高发的犬类疾病作为研究对象,对其综合防治的措施思路展开探究讨论。

犬细小病毒病防控技术研究进展

犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)感染会导致典型的急性胃肠炎,出现呕吐、发热、白细胞显著减少和出血性腹泻等症状,常与犬瘟热病毒、犬冠状病毒等其他病毒混合感染。尽管进行了广泛的疫苗接种,但CPV仍然是导致犬死亡的主要原因,幼犬死亡率常大于70%。通过对比不同类型CPV疫苗的不同特点及实际使用情况,同时分析免疫失败的原因,介绍目前诊断犬细小病毒病的主要方法及近年来取得的技术进步,对犬细小病毒病防控技术研究进展进行了综述,为犬细小病毒病的免疫、诊断及防控提供参考。

郑州地区犬细小病毒VP2基因遗传进化分析

为了解郑州地区犬细小病毒(CPV)的流行特征及遗传变异情况,采集81份2017—2022年郑州市疑似感染CPV犬的粪便或肛门拭子进行PCR检测。随机挑选出21份经PCR检测的CPV阳性样本,扩增其VP2基因,连接至载体并测序,用MegAlign软件对流行株进行同源性和氨基酸变异分析,并通过MEGA6.0软件构建基因遗传进化树。结果显示:2017—2018年郑州地区CPV流行基因型为New CPV-2a亚型,2019—2022年则以CPV-2c亚型为主导。21株CPV流行株与疫苗株的核苷酸同源性为98.3%~99.0%,其中CPV-79流行株与疫苗株的核苷酸同源性最低,仅为98.3%,且该毒株在VP2蛋白GH环区出现多位点氨基酸突变;部分CPV-2c亚型流行株第5和370位氨基酸出现A到G和Q到R的变异。研究结果表明:郑州地区当前流行基因型为CPV-2c亚型,虽出现多位点氨基酸突变,但未形成明显的国内进化分支。值得注意的是,New CPV-2a亚型在进化过程中形成了不同分支且存在抗原突变的风险。本研究丰富了郑州地区CPV的分子流行病学调查数据,也为我国CPV流行疫苗株的研制奠定了基础。

犬细小病毒病的流行特点及实验室诊断概述

犬细小病毒病是犬病中一种具有高度接触性传染的烈性传染病,是由犬细小病毒(CPV)引起的。1982年,犬细小病毒病出现在我国的东北、华东和西南等地区,主要发生在警犬和良种犬中。随着中国养犬数量的增加,犬细小病毒病的发病率也呈现上升趋势,给我国养犬业与宠物行业的发展造成了极大的危害。感染CPV的犬会在3~7天内发病,表现为严重的肠胃炎、精神菱靡、嗜睡、呕吐和发烧。CPV也会影响心肌细胞,导致急性心力衰竭,通常犬会在出生后8周内猝死。

自制“四黄汤”保留灌肠法治疗肠炎型犬细小病毒病的疗效观察

为了验证使用中药方剂治疗肠炎型犬细小病毒病的效果,将大黄、黄连、黄柏、黄芩按比例配伍制成“四黄汤”水提物浸膏,采用保留灌肠法给药治疗肠炎型犬细小病毒病患犬,另以犬五联血清治疗作为对照组进行比较。结果:使用“四黄汤”治疗26例,死亡7例,治愈19例,治愈率73%;用犬五联血清治疗30例,死亡12例,治愈18例,治愈率60%。结论:“四黄汤”保留灌肠法对肠炎型犬细小病毒病具有较好的治疗效果,是1种值得推广应用的临床治疗方法。

犬细小病毒病和犬瘟热二联组织灭活苗的免疫研究

本文综述了犬细小病毒病和防控策略,介绍了犬细小病毒病和犬瘟热二联组织灭活苗的制备及应用等方面的研究进展。对疫苗的安全性、有效性评价、疫苗接种后免疫应答的监测以及疫苗接种策略的制定等方面的研究也被详细阐述。本文总结了犬细小病毒病和犬瘟热二联组织灭活苗是防治这些疾病的有效手段之一,这可帮助人们更好地了解犬细小病毒病和犬瘟热的防控策略,从而为犬只的健康管理提供更多支持。

犬细小病毒悬浮培养工艺研究

研究旨在证明犬细小病毒(CPV)悬浮培养的可能性,提高CPV P6株抗原的病毒含量,降低转瓶生产不同批次间疫苗质量差异,生产质量稳定的疫苗产品。试验利用大孔的纤维编织物BioNOCⅡ型微载体所提供的巨大表面积,实现Vero细胞高密度培养,建立了Tide-cell生物反应器大规模培养CPV P6株抗原制备工艺。结果显示:生物反应器Tide-cell载体罐内接入1.0×10^(10)个F81种子细胞,在优化的参数条件下培养,用RPMI 1640培养液经过96 h培养,细胞总数为1.0×10^(11)个;在葡萄糖消耗量约为5 g/(L·h)时,按照病毒感染复数(MOI)=0.02将生产种毒CPV P6株接入Tide-cell微载体细胞培养瓶内,补加含8%血清的RPMI 1640病毒维持液至50 L,调整pH值为7.2~7.3,培养48 h收获,病毒含量至少为10^(7.43)TCID^(50)/mL。

犬细小病毒的预防诊治

犬细小病毒一年四季都在发生,以冬春季节较为多见,潜伏日期一般是7~14天(其传染率高达100%,致死率高达20~50%)。犬细小病毒传染源主要来自病犬的粪便、呕吐物或口水唾液,含毒量较高的是在病犬的粪便中,病犬和康复后的犬在较长时间内都会向外排毒,犬群中要是有此病毒感染,一般很难彻底将此病毒在犬群内清除。犬细小病毒在自然环境中有较顽强的存活力(该病毒在犬粪便中存活时间最长可达数月甚至数年)。犬细小病毒传播途径较多,直接或间接接触都能进行快速传播(主要的感染方式是消化道感染)。

汝州市犬细小病毒的PCR检测及VP2基因序列分析

为了解汝州市犬细小病毒的流行和变异情况,本研究调查了汝州市3家动物诊所接诊的20例疑似感染犬细小病毒病例。PCR结果显示,15份样本为犬细小病毒阳性。VP2蛋白氨基酸序列分析结果显示:12株犬细小病毒的基因亚型为CPV-2c,3株犬细小病毒的基因亚型为CPV-2a;分离得到的15株犬细小病毒其氨基酸序列同源性为99.1%~100.0%,与疫苗株的同源性为97.5%~98.6%,与其他国内外参考毒株的同源性为98.0%~100.0%;分离的12株CPV-2c型毒株与我国广西等地分离的CPV-2c型毒株具有较近的亲缘关系;分离的3株CPV-2a型毒株与我国广州等地分离的CPV-2a型毒株属于同一支。对汝州市犬细小病毒的流行调查,为该地区犬细小病毒病的防控提供了理论基础。

浅谈犬细小病毒病的中西兽医结合疗法优势互补效果观察

犬细小病毒病是犬类养殖常见的烈性传染病,近几年,犬细小病毒病在农牧区犬及城镇宠物犬的养殖中时有发生,断乳至3月龄犬发病较多见,感染犬临床表现呕吐腹泻,病程长短不一,最后衰竭死亡。一般用常规抗病毒、抗感染等药物治疗效果不佳,死亡率极高。笔者通过多年临床治疗,反复试验,制定了中西兽医结合治疗方案,根据该病发生、发展、临床特点等,将中西兽医结合治疗、预防措施及效果等进行总结,以期为犬细小病毒病的治疗提供参考。

犬细小病毒胶体金免疫层析试纸卡的研制

本研究采用免疫胶体金技术(immune colloidal gold technique,ICGT),以犬细小病毒单克隆抗体作为胶体金的标记物及检测线诊断物、羊抗鼠IgG抗体作为质控线,制备犬细小病毒胶体金免疫层析试纸卡。结果显示,制备的试纸卡可在10 min内完成显色,对其他犬源病毒不存在交叉反应,具有较高的特异性;犬细小病毒灭活病毒液的梯度稀释检测结果显示,制备的试纸卡具有较高的灵敏度,可达到4×10^(9)TCID50/mL;通过对50份样本的检测,并与PCR结果进行比对,符合率达92.00%;同时,试纸卡可在室温(22~25℃)稳定保存约8个月,在4℃环境中稳定保存约10个月。本研究所制备的犬细小病毒胶体金免疫层析试纸卡具有较高的敏感性、特异性、重复性与稳定性,对犬细小病毒的临床诊断评估具有一定的参考意义。

犬细小病毒感染F81细胞microRNA荧光定量PCR内参基因的筛选

犬细小病毒(canine parvovirus, CPV)是犬急性胃肠炎的主要病原之一,对犬类的健康造成极大危害。MicroRNA(miRNA)是小的、非编码的RNA,在转录后水平调节基因表达。荧光定量PCR(RT-qPCR)是评估miRNA表达水平最常用的方法,而合适的参考基因在RT-qPCR数据归一化中起着至关重要的作用。本研究在分析F81细胞空白对照组和感染CPV组小RNA高通量测序结果基础上,结合参考文献,在CPV感染后12 h和24 h,通过poly(A)延伸RT-qPCR定量方法检测候选内参基因小RNA的表达情况,并使用GeNorm、NormFinder和BestKeeper算法评估这些候选小RNA的稳定性。结果选取了5种高通量测序中表达相对稳定的miRNAs(dno-miR-186-5p、pha-miR-152、dno-miR-374a-5p、tch-miR-26a-2-5p和oga-miR-26b)和常用作参考基因的小核RNA U6(RNU6-1)、核仁小RNA(small nucleolar RNA)SNORD95以及SNORD96a,经过扩增分析及对高通量测序中差异表达的dno-miR-7-5p的定量验证发现,这些候选小RNA均具有较好的稳定性。其中pha-miR-152在检测样品中稳定性最好,可在CPV感染F81细胞中作为RT-qPCR法定量miRNA表达及数据均一化的合适参考基因。筛选出的pha-miR-152有助于研究miRNAs在CPV感染过程中的定量表达分析,为进一步研究F81细胞中miRNA调控CPV感染复制的分子机制研究提供可靠手段,也为其他相关物种miRNA定量研究中内参基因的选择提供参考。

犬细小病毒新乡株的分离鉴定及其VP2基因的序列分析

【目的】探究河南省新乡地区犬细小病毒(Canineparvovirus,CPV)的流行和遗传变异进化情况,为有效防控区域性CPV流行提供参考。【方法】对从新乡地区宠物医院收集的23份疑似患犬细小病毒病的病犬粪便样品和眼、鼻、口、肛拭子预处理后进行PCR检测。将PCR检测结果为阳性的样品采用浸泡、过滤除菌处理后接种于单层猫肾细胞CRFK进行病毒增殖培养,将分离的病毒置于透射电子显微镜下观察。参考GenBank中已收录的国内外CPV不同亚型的毒株序列,经PCR分段扩增、测序后拼接获得病毒全长基因,利用分子生物学软件对病毒基因进行序列分析和氨基酸序列同源性分析。【结果】从送检的样品中成功分离出1株CPV,命名为XX-2022株。该病毒株能使CRFK细胞产生明显病变,导致细胞出现变圆、拉网和脱落。通过透射电镜可观察到典型的病毒粒子,呈圆形或六边形,直径约25 nm,无囊膜。通过PCR分段扩增拼接后获得的病毒全基因组序列全为长4588 bp,CPV系统进化分析结果显示,XX-2022株与Canine/SH/1/2019(MN840830.1)株的亲缘关系较近。利用MegAlign软件对XX-2022株VP2基因推导的氨基酸序列进行分析,该毒株与YANJI-5(MW715601)的VP2氨基酸序列在同一小分支,氨基酸同源性为99.7%。根据CPV的基因分型原则,最终确定XX-2022株CPV属于CPV-2a型。【结论】从临床病料中成功分离出1株CPV,经分析确定为CPV-2a型,研究结果可为新乡地区CPV的流行病学、致病性及生物学特性研究提供依据,为CPV的区域流行及有效防控提供参考,为新疫苗的研发提供地方种毒。

犬细小病毒吉林流行株的分离鉴定及VP2基因的遗传进化分析

从吉林省长春市某动物医院采集了3份CPV阳性宠物犬粪便样品,经PCR鉴定,使用F81细胞进行盲传,同时对病毒进行血凝、电镜观察及间接免疫荧光等检测后,对其VP2基因进行序列分析。结果显示,3株CPV分离株为CPV-2c型犬细小病毒(命名为CPV-JL21-L1、CPV-JL21-L2、CPV-JL21-L3),第20代病毒滴度均在10^(-7)~10^(-7.5)TCID50/0.1 mL之间,第20代血凝效价结果均保持在210~211。VP2基因序列遗传进化分析显示,3株CPV分离株与3株疫苗株VP2基因的同源性为98.6%~99.0%,与其他参考毒株同源性为98.6%~99.9%。此外,分离株CPV-JL21-L1和CPV-JL21-L3在80 L、101 T、267 Y、297 A、300 G、324 I、375 D、426 E和555 V位点与国内流行株相同,CPV-JL21-L2在267位点氨基酸发生了变异。本研究为吉林省CPV分子流行病学的调查提供理论依据。

犬细小病毒病的诊断及综合治疗方案

犬细小病毒病又称为犬细小病毒性肠炎、传染性出血性肠炎、犬传染性肠炎,由犬细小病毒所引起的一种高度接触性、致死性传染病。感染发病主要在幼犬,多经由消化道感染病毒,表现为胃肠炎和(或)心肌炎,多发于冬季和春季,是犬烈性传染病,准确诊断、合理治疗对于犬业有重要意义。

狂犬病、犬瘟热和犬细小病毒病三联灭活疫苗免疫效果评价

狂犬病、犬瘟热和犬细小病毒病是当前危害养犬业的三种重要传染病。为探讨狂犬病毒(RABV)、犬瘟热病毒(CDV)和犬细小病毒(CPV)灭活制备三联灭活疫苗的可行性,将该3种病毒HEP-Flury株、LN(10)1株和JL(18)1-Beagle株分别在BHK-21、Vero/DogSLAM(VDS)和F81细胞培养,经β-丙内酯灭活剂灭活后,分别与三种不同类型免疫佐剂(MONTANIDE GEL 02、ADJ-801(W)、Al(OH)3)配制成三联灭活疫苗。疫苗经三次免疫比格犬后,通过测定动物血清抗体水平和攻毒保护情况评价其免疫效果。实验结果显示,不同佐剂的三联灭活疫苗对增强比格犬RABV、CDV和CPV血清抗体应答反应效果不同。其中ADJ-801(W)佐剂能显著提高针对RABV、CDV和CPV三种病毒的抗体水平,疫苗三次免疫比格犬后血清抗体效价分别为7.4 EU/mL、1∶50和1∶1024;而Al(OH)3佐剂效果较差,三免后抗体效价分别为4.01 EU/mL、1∶6和1∶256。疫苗三次免疫后,分别应用强毒CDV SD(14)7株和CPVJL(18)1-Beagle株对比格犬进行攻毒实验,实验结果显示,ADJ-801(W)组对SD(14)7和JL(18)1-Beagle攻毒保护率均为100%,MONTANIDE GEL 02组攻毒保护率均为60%,而Al(OH)3组攻毒保护率均为0,表明ADJ-801(W)佐剂制备的狂犬病、犬瘟热和犬细小病毒病三联灭活疫苗对比格犬提供较好的免疫保护作用。本研究为犬狂犬病、犬瘟热和犬细小病毒病三联灭活疫苗的研制奠定了基础。

犬细小病毒VP2蛋白特点及病毒样颗粒疫苗制备研究进展

犬细小病毒病危害犬的健康,传统疫苗不能有效保护犬免受病毒的侵扰,寻求新的疫苗是当前研究和关注的热点。VP2蛋白是犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)的主要保护性抗原蛋白,在决定宿主范围和入侵过程中起重要作用。此外,VP2蛋白在N-端结构域和环结构域中含有几个重要的B细胞表位,可在CPV感染过程中诱导产生有效的中和抗体。因此,在开发CPV基因组亚单位疫苗中,VP2蛋白可作为候选抗原的首选。病毒样颗粒(VLPs)与天然病毒相似,但不具备天然病毒的复制功能引起机体发生感染,故近几年来利用不同的表达系统组装VP2蛋白一直是研究者们研究的重点。笔者着重对CPV VP2蛋白的特点及构象进行分析,通过特点分析得知CPV衣壳的主要成分中含有VP2,不但具有血凝活性,还与CPV的宿主范围和抗原性密切相关,因此,有活性的VP2蛋白在CPV基因工程亚单位疫苗的开发中极其重要。通过构象分析得知CPV VP2蛋白环状结构(Flexible loop)具有更大的灵活性,这可能是CPV感染宿主范围不断扩大的分子基础。同时笔者对VLPs疫苗的制备方法及优缺点进行讨论,以期为CPV疫苗的研究制备提供有利的参考和科学依据。

犬细小病毒性肠炎的特点和防治经验总结

细小病毒性肠炎是犬饲养时常见的一类胃肠道急性传染.病,该病也称之为犬细小病毒病,具有较强的传染性及较大的危害性,患病犬会出现明显的腹泻、便血、呕吐等症状,若治疗不及时死亡率极高,进而造成经济损失,因此做好犬细小病毒性肠炎的防治工作具有重要的现实意义。