郑州地区犬细小病毒VP2基因遗传进化分析

为了解郑州地区犬细小病毒(CPV)的流行特征及遗传变异情况,采集81份2017—2022年郑州市疑似感染CPV犬的粪便或肛门拭子进行PCR检测。随机挑选出21份经PCR检测的CPV阳性样本,扩增其VP2基因,连接至载体并测序,用MegAlign软件对流行株进行同源性和氨基酸变异分析,并通过MEGA6.0软件构建基因遗传进化树。结果显示:2017—2018年郑州地区CPV流行基因型为New CPV-2a亚型,2019—2022年则以CPV-2c亚型为主导。21株CPV流行株与疫苗株的核苷酸同源性为98.3%~99.0%,其中CPV-79流行株与疫苗株的核苷酸同源性最低,仅为98.3%,且该毒株在VP2蛋白GH环区出现多位点氨基酸突变;部分CPV-2c亚型流行株第5和370位氨基酸出现A到G和Q到R的变异。研究结果表明:郑州地区当前流行基因型为CPV-2c亚型,虽出现多位点氨基酸突变,但未形成明显的国内进化分支。值得注意的是,New CPV-2a亚型在进化过程中形成了不同分支且存在抗原突变的风险。本研究丰富了郑州地区CPV的分子流行病学调查数据,也为我国CPV流行疫苗株的研制奠定了基础。

大熊猫源犬细小病毒VP2基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

【目的】建立一种检测大熊猫血清中犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)抗体的间接酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法。【方法】以大熊猫源CPV DNA为模板,利用PCR扩增VP2基因,再用原核表达系统对VP2基因进行表达,经纯化后的蛋白作为ELISA包被抗原;制备并纯化兔抗大熊猫IgG,采用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记作为间接ELISA酶标二抗,通过棋盘法确定抗原包被质量浓度及血清稀释度等条件,并评估建立方法与商业试剂盒检测样品结果的符合率。【结果】原核表达成功获得约70 ku的VP2蛋白,将其作为间接ELISA包被抗原,抗原最佳包被质量浓度为2.0μg/mL,血清最佳稀释度为1∶400,用该方法进行检测血清样品时OD450≥0.258为阳性,反之为阴性。采用建立的ELISA方法检测大熊猫血清样本阳性率为60.0%,高于商业化检测试剂盒检测的阳性率(52.5%),两者总符合率达到87.5%。【结论】本研究首次建立了基于大熊猫源CPV VP2蛋白为抗原、自制HRP标记兔抗大熊猫IgG为酶标二抗的间接ELISA方法,该方法特异性强、灵敏性较高、重复性好,为大熊猫血清中CPV抗体的检测提供了技术支持。

犬细小病毒VP2基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的表达犬细小病毒VP2蛋白(CPV VP2),用于犬细小病毒病的诊断、疫苗研制和VP2蛋白功能研究。方法采用PCR方法对CPV VP2基因进行扩增,将CPV VP2基因克隆到毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌表达载体pPICZαA中,构建真核重组表达载体pPICZαA-VP2,将该重组质粒线性化后,转化毕赤酵母菌GS115中,在甲醇诱导下表达CPV VP2,SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达蛋白。结果成功扩增了CPV VP2基因,构建了真核重组表达载体pPICZαA-VP2在毕赤酵母菌中表达出约64.35 kD蛋白。Western blotting鉴定表明,表达VP2蛋白与犬细小病毒阳性血清有反应性。结论在毕赤酵母中成功地表达了CPV VP2蛋白,能被犬细小病毒阳性血清识别。

犬细小病毒VP2基因的比较及分型研究

为查明我国CPV的流行变异情况及为进一步的免疫研究奠定基础,对我国不同地区分离到的9株细小病毒毒株进行了VP2基因的扩增和序列分析,并与CPV的参考毒株进行了比较分型, 9 株CPV 中有6 株属CPV 2a,3株属CPV 2b,但未分离到CPV 2c变异株,结果表明我国目前仍以CPV 2a流行为主。

贵阳地区犬细小病毒VP2基因的克隆及遗传进化分析

为研究贵阳地区犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)的流行基因型及其遗传进化情况,本试验对从贵阳市分离的10株CPV的VP2基因进行PCR扩增和克隆并进行序列分析。结果显示,分离的病毒能使F81猫肾细胞产生明显的细胞病变(CPE),分离的10株病毒中,7株为CPV-2a亚型,3株为CPV-2c亚型,命名为GY-1~GY-10。10株CPV分离株与疫苗株VP2基因的同源性98.4%~99.4%,与其他国内外参考株的同源性为97.7%~99.9%。本试验首次报道贵阳市CPV的流行基因型为CPV-2a亚型并伴随CPV-2c亚型存在,对监测CPV遗传变异趋势及疫苗的研制具有重要意义。

犬细小病毒VP2基因的克隆与生物信息学分析

本研究旨在克隆犬细小病毒VP2(Canine parvovirus VP2,CPV-VP2)基因,构建克隆载体pMD18-T-VP2,分析其生物信息学特征。以犬细小病毒(CPV)阳性病犬血液基因组病毒DNA为模板,PCR扩增CPV-VP2基因,通过TA克隆获得pMD18-T-VP2重组质粒,测序后对其进行生物信息学分析。结果表明:(1)CPV-VP2完整的开放阅读框由1755个核苷酸组成,共编码585个氨基酸残基,其序列同源性与浣熊最高,达97.6%;(2)信号肽在线预测认为,CPV-VP2基因无信号肽;(3)CPV-VP2大多数氨基酸偏好以T、A结尾的密码子;(4)CPV-VP2蛋白可能存在7个糖基化位点,其丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸分别存在8个、10个和7个磷酸化位点;(5)CPV-VP2可能存在76个B细胞抗原表位;(6)CPV-VP2蛋白为亲水性蛋白,无跨膜结构;(7)CPV-VP2蛋白二级结构的α-螺旋区域占9.93%、β-折叠区域占24.49%、无规则卷曲区域占65.58%;(8)CPV-VP2蛋白三级结构存在多个螺旋和折叠区域,主要以无规则卷曲为主。本研究为制定CPV-VP2基因原核或真核高效表达策略提供了参考资料,并为进一步制备CPV胶体金快速诊断试纸条和基因工程疫苗奠定了基础。

犬细小病毒VP2基因测序分析

为了解贵阳市犬细小病毒(CPV)VP2基因的遗传变异情况,从贵阳市黔灵动物医院采集经试剂盒检测为阳性的患犬粪便13份,对粪样进行病毒DNA的提取,并以此DNA为模板,进行PCR扩增,随机选取3株PCR阳性产物对其VP2基因进行序列测定与遗传变异分析。结果显示,抗原快速检测试剂盒与PCR检测结果符合率达76.9%;3个试验毒株之间VP2基因同源性达96.5%～97.3%,与参考毒株同源性为95.2%～96.8%;由遗传进化树可见,与国内分离毒株的亲缘性略高于国外分离株。结果表明,CPV抗原快速检测试剂盒与PCR法符合率较高,3个试验毒株与国内外流行毒株之间差异性不大。

成都地区犬细小病毒VP2基因克隆分析及基因型鉴定

根据GenBank中犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)VP2基因序列设计合成两对特异性引物1F/1R和2F/2R,从疑似CPV感染病犬的粪便病料中提取DNA作为模板,分段扩增涵盖VP2基因的两个片段,大小分别为1325和758bp,并进行克隆、测序,通过拼接得到11条长度为1755bp的VP2基因完整序列。核苷酸同源性分析表明,扩增得到的11个完整VP2基因序列与GenBank中发布的21株国内外参考毒株比较,核苷酸同源性为96.2%～99.8%。采用DNAStar软件分析,预测VP2蛋白可能成为B细胞表位的区段位于Met1-Val38、Met73-Val82、Met96-Ala103、Lys151-Thr170、Gly235-Phe243、Leu294-Phe303、Ala359-Thr399、Ile469-His483、Ala503-Arg520、Lys570-Tyr584。将扩增获得的VP2基因编码的氨基酸序列与CPV参考毒株进行比较,第426位和第555位氨基酸残基分别为Asp和Val,鉴定出本试验得到的CPV基因型均为2a型,初步证实成都地区仍以CPV-2a为主要流行毒株。

犬细小病毒VP2基因编码主要抗原表位区的核酸免疫及其免疫原性研究

为评价犬细小病毒(CPV)VP2主要抗原表位的免疫原性,本研究对CPV YZ株VP2的氨基酸序列进行分析,确定了主要抗原表位区域(VP2-228),通过PCR扩增相应的表位编码区域基因片段(700 bp),将其克隆于真核表达载体p VAX1中构建重组真核表达质粒p VAX1-VP2-228。Western blot结果显示VP2-228能够在COS-7细胞中正确表达。将该重组质粒免疫小鼠,利用血凝抑制试验检测不同时期的抗体水平,以MTT法检测免疫35 d时淋巴细胞的增殖活性。结果表明p VAX1-VP2-228能够诱导小鼠产生较高的抗体水平;淋巴细胞增殖试验表明免疫小鼠的淋巴细胞刺激指数显著高于对照组(p<0.05)。本研究为开展CPV DNA疫苗的研究提供了实验依据。

云南省犬细小病毒VP2基因检测分析

为了解云南省犬细小病毒VP2基因分子流行变异情况,对来源于云南省7个地级市13个犬细小病毒样品进行了VP2基因的扩增和序列分析,并与相关参考序列进行了遗传进化比对分析。结果表明,13个样品中9个基因型为CPV-2a,3个基因型为CPV-2b,1个基因型为CPV-2。氨基酸序列变异主要集中在297位-518位氨基酸处,其中324位和440位氨基酸变异在犬细小病毒进化过程中扮演着重要角色。遗传进化分析显示10个样品序列形成了一个相对于国内外参考序列独立的遗传进化分支,提示云南省犬细小病毒以CPV-2a基因型流行为主。

犬细小病毒VP2基因原核表达条件优化与蛋白纯化

为了提高犬细小病毒VP2基因在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中的表达量,通过改变诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度等条件对表达量产生影响,以SDS-PAGE电泳分析证明VP2基因蛋白表达的最佳条件,并通过Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱法纯化目的蛋白。结果表明,重组质粒E.coliBL21(DE3)在35℃,1.0 mmol/mL IPTG诱导6 h时条件下蛋白表达量最高。SDS-PAGE电泳检测的纯化目的蛋白约为90 kDa,与预计大小一致。VP2基因融合蛋白的优化表达和纯化为研究犬细小病毒亚单位疫苗奠定了基础。

犬细小病毒VP2基因的克隆表达与免疫印迹分析

根据基因库已发表犬细小病毒序列设计合成了VP2基因的1对特异引物,以细小病毒感染的犬粪样品中提取的总DNA为模板,进行PCR扩增。把扩增产物克隆至pMD18-T载体进行测序、鉴定。将克隆的VP2基因片段克隆至原核表达载体pGEX-4T-2,再将构建成功的原核表达质粒载体pGEX-4T-2-VP2转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,进行鉴定、测序、表达。结果表明,克隆的VP2基因片段全长1 755 bp,与13个VP2基因序列的同源性为98.4%～99.8%。系统进化树分析表明,所克隆的VP2 CSN830611序列同日本株(AB054222)、意大利株(AF306445)的进化途径一致。Western-blotting分析显示,表达产物为90 kD的融合蛋白,可被犬细小病毒阳性血清所识别,具有良好的反应原性。

犬细小病毒VP2基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达与检测

为表达犬细小病毒VP2蛋白(CPVVP2),用于犬细小病毒病的诊断、疫苗研制和VP2蛋白功能研究,根据基因库已发表犬细小病毒序列设计合成了VP2基因的1对特异引物,以细小病毒感染的犬粪样品中提取的总DNA为模板,进行PCR扩增,把扩增产物克隆至pMD18-T载体进行测序、鉴定。将克隆的VP2基因片段克隆至原核表达载体PGEX-6P-1,再将构建成功的原核表达质粒载体PGEX-6P-VP2转化至大肠杆菌BL21中,进行鉴定、测序、表达。结果表明,克隆的VP2基因片段全长1755bp,与6个VP2基因序列的同源性为98.7%～99.7%。Western-blotting分析显示,表达产物约为90kD的融合蛋白,可被犬细小病毒阳性血清所识别,具有良好的反应原性。

犬细小病毒VP2基因的扩增、序列分析及其原核表达

为了制备犬细小病毒（CPV）VP2蛋白抗原，试验采用PCR方法，以一例疑似CPV感染的出血性肠炎患犬粪便为样品对VP2基因进行扩增，并将该目的基因克隆到pMD18-T质粒上。进行EcoRI／HindⅢ双酶切鉴定及测序鉴定；对该基因进行序列分析后将VP2基因克隆到原核表达载体pET-32a上，并转化E．coliBL21（DE3），诱导表达后进行Ni-NTA亲和层析纯化、Western—blot试验验证其生物活性。结果表明：克隆的基因全长为1790bp；该基因序列与已报道的CPV基因序列同源性高达99．2％～99．9％，氨基酸同源性达99．0％～99．8％，为新CPV-2a基因亚型，其中与泰国株GQ379042．1亲缘性最高，仅1个碱基不同，与猫细小病毒同源性高达98．69％；获得了87ku的目的蛋白。说明该临床病例确为CPV感染。该株细小病毒VP2蛋白的成功表达可为吉林省CPV流行病学调查提供资料，可用于进一步的疫苗研究及免疫学方法的建立。

犬细小病毒VP2基因的生物信息学分析

近年来，随着我国饲养宠物的人群迅速扩大，宠物疾病严重危害这个群体的健康。张晋等人对2007年北京地区犬的流行病发病情况进行了统计分析，结果表明，犬细小病毒病是北京地区犬病毒病中最主要的流行病。

犬细小病毒VP2基因序列分析

2006～2007年间,从中国农业大学动物医院采集的犬细小病毒粪便样本中随机抽取20份,采用PCR技术,扩增了这20份样本的犬细小病毒VP2全基因序列。经核苷酸及推导的氨基酸序列分析发现,20个样本中,有19个样本属于CPV-2a,1个为CPV-2b,且所有病毒样本的297位均发生Ser→Ala的置换;基因型为CPV-2a病毒样本的555位均发生回归性置换(Ile→Val)。与经典的CPV-2a/b毒株比较,部分样本还出现了新位点氨基酸置换现象。其中,样本CPV/BJ005/07与CPV/BJ008/07VP2的139位氨基酸残基由Val置换为Ile;80%(16/20)的样本在324位有Tyr→Ile的置换;样本CPV/BJ004/07和CPV/BJ050/07分别在226(Ser→Asn)与382(Arg→Lys)位发生置换。运用DNAStar软件对上述置换的氨基酸残基进行综合分析发现,除Ile-139突变意义不大外,Ile-324、Asn-226和Lys-382均处在VP2蛋白潜在的抗原表位区域,有着重要的生物学意义。

犬细小病毒VP2基因序列分析及BJ-1株的分离鉴定

为分离犬细小病毒毒株,对临床经胶体金试纸条检测CPV阳性的8份犬粪便样品进行VP2全长编码片段扩增与测序。VP2片段序列分析结果显示,8株临床样品的VP2基因全长均为1755 bp,氨基酸的同源性为98.5%~100%。遗传进化分析显示,所有分离的毒株均与所参考的中国分离株在一个分支上。其中1株属于New CPV-2b,其余7株均为New CPV-2a。在序列分析基础上,选择北京地区的1份犬粪便样品,接种F81细胞进行病毒分离。粪便样品接种F81细胞盲传5代后出现典型的病变。对该毒株进行电镜观察、免疫荧光试验以及蛋白电泳鉴定。电镜观察显示病毒粒子的外形结构为圆形或六边形,直径约25 nm,可见实心和空心病毒粒子。间接免疫荧光结果显示,接种病毒液的细胞出现特异性亮绿色荧光信号,对照细胞无荧光信号。纯化后的病毒蛋白电泳显示两条清晰的条带分别为VP1(76 ku)、VP2(64 ku)。结果表明,成功分离到1株New CPV-2a亚型毒株,并将其命名为CPV BJ-1株。

重组犬瘟热病毒抗原表位T'TB和犬细小病毒vp2基因的真核表达

将人工合成的犬瘟热病毒抗原表位T'TB基因克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的转移载体pFastBacHTc上,命名为pFastBacHTc-T'TB。应用PCR方法扩增犬细小病毒vp2基因,将其克隆至pMD18-T载体,测序后将vp2基因插入T'TB基因下游,命名为pFastBacHTc-T'TB-VP2,进而转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,获得携带犬瘟热病毒T'TB细胞表位和犬细小病毒vp2基因的重组转染质粒Bacmid-BacHT-T'TB-VP2,转染昆虫细胞Sf-9后获得融合重组T'TB-VP2蛋白,大小约为70ku。经Westernblot分析,表达的蛋白可与犬细小病毒阳性血清反应,具有良好的免疫原性。

犬细小病毒VP2基因真核表达质粒的构建与瞬时表达

【目的】构建犬细小病毒(CPV)VP2基因真核表达质粒,为研究核酸疫苗奠定基础。【方法】根据CPVVP2基因序列设计特殊引物,采用PCR方法从疑似"犬细小病毒"的患犬粪便基因组中扩增VP2基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),测序验证后,小白鼠尾静脉注射瞬时表达VP2基因,8 h后取小白鼠肝脏提取总RNA,进行RT-PCR扩增。【结果】在病犬粪便基因组中扩增得到1 755 bp的VP2基因片段,并构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)-VP2,从瞬时表达的小白鼠肝脏总RNA中可扩增到目的条带。【结论】成功构建了犬细小病毒VP2基因真核表达重组质粒,并在小白鼠体内进行了瞬时表达。

广州地区犬细小病毒VP2基因的序列分析

犬细小病毒病是一种高度接触性传染病,临床上以急性出血性肠炎和心肌炎为特征。为研究广州地区犬细小病毒病的流行亚型,本试验采集2011—2012年间疑似病犬粪便,进行犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)分离鉴定,提取病毒基因组进行VP2基因扩增和序列分析,与GenBank中登录的参考毒株进行比对,结果发现,分离的8株CPV中SCAU-5为CPV-2b亚型,其余为CPV-2a亚型。结果表明,2011—2012年间广州地区的流行毒株以CPV-2a亚型为主。