稳定过表达犬EGFR蛋白的MDCK细胞的建立及其对凋亡和细胞周期的影响

表皮生长因子受体(EGFR)在许多实体肿瘤中过度表达,建立稳定过表达犬EGFR蛋白的MDCK细胞株,有利于为研究犬或人类肿瘤疾病提供良好的细胞模型和研究基础。首先制备目的片段以构建EGFR基因过表达载体,与慢病毒包装载体共同转染至293T细胞中,48 h后提取上清液经纯化获得EGFR基因过表达慢病毒液。将其转染至MDCK细胞中,经嘌呤霉素筛选和单细胞克隆后观察感染效率,RT-qPCR和Western Blot、间接免疫荧光分别检测基因及蛋白的表达,建立EGFR蛋白过表达MDCK细胞株。使用流式细胞仪分别检测过表达及对照细胞株的细胞凋亡和细胞周期。犬EGFR基因位于18号染色体,由编码跨膜糖蛋白的30个外显子组成。经反应体系,PCR产物交换入线性化表达载体,获得了阳性转化子8个,大小为738 bp。所获EGFR基因过表达慢病毒滴度为3.5×10^(8 )TU/mL。转染MDCK细胞后在荧光显微镜下观察荧光效果显著,经检测EGFR基因及其蛋白在细胞中的表达量显著升高。间接免疫荧光试验显示,EGFR在细胞中表达明显增强。过表达细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率显著上升,且在G2/M期发生阻滞。成功建立一株稳定的犬EGFR过表达MDCK细胞株,犬EGFR的过表达催化了细胞分裂,使DNA复制加快,同时刺激了细胞凋亡。

犬肾脏肾母细胞瘤的病例报告

犬肾脏肾母细胞瘤是一种罕见的恶性肿瘤,常发生于幼年动物,预后谨慎。目前国外报道的此类病例较少,国内报道的此类病例更为罕见。2021年5月中国农业大学动物医院接诊1例犬右肾肾母细胞瘤的病例,手术治疗后患犬生存期为10个月。本文通过论述该病例的诊断和治疗过程,以期为临床上诊疗此类疾病提供一些参考。

流感监测中流感病毒优势株在犬肾细胞系(MDCK细胞模型中竞争性复制的意义

目的通过流感病毒优势株在犬肾细胞系(Madin-Daby canine kidney cells,MDCK)细胞中竞争性复制,探讨季节性流感流行株感染、复制能力强弱对主导流行株的贡献。方法在对2011年至2012年上海市闵行区季节性流感监测中,监测到流感样病例775例,确诊流感病例119例。选取2012年1月至2月流感病例中分离的3株B型和3株A/H3N2亚型流感流行株,两两交叉配对成9组,共同感染MDCK,细胞培养上清液抽提核酸,mRT-PCR扩增特异性产物。结果有7组共感染组合中A/H3N2(210bp)电泳条带逐渐变强、B型条带(390bp)逐渐变弱至第3代完全消失,2组中A/H3N2与B的条带至第3代均明亮。结论流感病毒共感染竞争性复制结果与当时人群流感监测中优势株转换相符。该方法为探讨可能引起主导流行株在人群中变迁的原因提供了研究思路。

流感病毒鼠肺适应株FM1诱导犬肾细胞MDCK凋亡的实验研究

流感病毒鼠肺适应株FM1攻击犬肾细胞36 h后,通过对其细胞形态学的观察、DNA电泳图谱的分析及流式细胞仪的检测,显示受到病毒攻击后犬肾细胞在形态学上主要表现为细胞圆缩,核固缩、碎裂等,在细胞周围形成典型的圆形凋小体;琼脂糖凝胶电泳实验图谱可见到清晰的ladder梯状条带;流式细胞仪的检测提示在正常的二倍体峰前可见明显的亚二倍体峰,并有一定的细胞凋亡率。根据以上结果可得出结论:在流感病毒鼠肺适应株FM1攻击犬肾细胞MDCK后诱导了细胞凋亡的发生。

基于MDCKⅡ细胞的中药成分体外肾毒性评价

目的用狗肾近端小管上皮（MDCKⅡ）细胞系研究中药成分的肾毒性，探讨其作为评价中药成分肾毒性体内动物实验替代方法的可能性。方法以氯化汞（HgCl2）为阳性对照，研究已知有肾毒性的马兜铃酸Ⅰ（AAⅠ）和马兜铃酸Ⅱ（AAⅡ），以及未见肾毒性报道的苦参碱、氧化苦参碱和肉豆蔻醚对MDCKⅡ细胞的毒性作用。用MTT法检测细胞存活；倒置显微镜观察细胞形态改变；乳酸脱氢酶（LDH）释放实验检测细胞膜损伤；流式细胞术分析细胞周期及细胞凋亡，用Hoechst33258染色法观察凋亡细胞形态变化。结果AAⅠ和AAⅡ分别与MDCKⅡ细胞作用24，48和72h细胞存活均被明显抑制，AAⅠ的IC50值分别为（63．4±6．6），（44．8±6．0）和（37．3±4．6）μmol·L^-1，AAⅡ的IC50值分另4为（125．7±6．2），（106．7±20．4）和（94．2±9．7）μmol·L^-1；在5—300μmol·L^-1时AAⅠ和AAⅡ分别与MDCKⅡ 细胞作用24h，LDH的释放率明显增高；AAⅠ（75μmol·L^-1）和AAⅡ（150μmol·L^-1）分别与MDCKⅡ细胞作用24h，倒置显微镜下可见细胞收缩变圆，部分细胞破裂脱落；用流式细胞仪和Ho-echst33258染色法观察亦发现，AAⅠ和AAⅡ均可使细胞周期S期阻滞，诱导MDCKⅡ细胞发生凋亡。苦参碱、氧化苦参碱和肉豆蔻醚在2～10mmol·L^-1浓度范围内分别与MDCKⅡ细胞作用24h，对上述指标均无明显影响。结论 MDCKⅡ细胞系对有肾毒性的AAⅠ和AAⅡ和未见肾毒性报道的苦参碱、氧化苦参碱和肉豆蔻醚的反应不同，可用于中药成分体外肾毒性评价。

麻杏石甘汤对A型流感病毒感染的犬肾传代细胞凋亡的影响

目的:探讨麻杏石甘汤对A型流感病毒感染的犬肾传代(MDCK)细胞凋亡的影响。方法:运用原位末端标记技术和流式细胞术分别检测最大无毒限量的麻杏石甘汤对A型流感病毒感染的MDCK细胞凋亡百分率与细胞周期变化的影响。结果:麻杏石甘汤能显著降低A型流感病毒感染的MDCK细胞的凋亡百分率,下调其G1/G0期细胞比例,上调其S期、G2/M期细胞比例以及细胞增殖指数(PI)值。结论:麻杏石甘汤通过调整流感病毒感染的MDCK细胞的细胞周期,降低细胞凋亡百分率而发挥抗流感病毒作用。

应用套式PCR在MDCK细胞系中发现犬细小病毒

本研究自 1 997年至 1 999年从国内部分大学实验室、卫生防疫站和动检局陆续收集 1 1个犬肾 (MDCK)细胞系样品 ,选取犬细小病毒基因组的VP2 基因上 4段核苷酸序列作引物 ,对样品DNA进行套式PCR(NestedPCR)检测 ;PCR扩增产物经 0 0 1g/mL琼脂糖凝胶电泳和克隆到pGEM-T载体并进行核苷酸序列测序鉴定后 ,发现我国MDCK细胞系中存在犬细小病毒的传代病毒株 该病毒基因组部分序列测定结果显示与犬细小病毒CPV N株有 91 %同源性 .

犬肾细胞系的染色体组型分析与致癌/致瘤性的实验研究

以人类子宫颈癌细胞系Hela为阳性对照 ,以连传 3代的犬、猫肾原代细胞 (CKC、FKC)为阴性对照 ,对来自国内外不同单位收集的 4株MDCK传代细胞系培养 2 5～ 4 5代的完整活细胞或冻融裂解细胞进行裸鼠致癌 /致瘤实验观察 ,筛选出致癌性极低、符合细胞遗传学要求、无传染因子污染的几株MDCK细胞系用于制苗 ,并建立了相应的细胞种子库和工作库 ,供科研和生产使用 ,4年运转很好。不同代次MDCK细胞系染色体众数所占比率的相差率一般不超过 5 %～ 15 % ,结构畸变率一般为 0～ 3%。研究表明 ,MDCK细胞染色体遗传特征决定致瘤性质 ,并具有种属特异性 ,MDCK细胞不论核型如何 ,始终具有致癌性 ,但其致癌 /致瘤性差 ,只有超二倍体以上细胞才具有高的致癌 /致瘤率 (如YA株的为 2 8/ 5 8) ,亚二倍体细胞的致癌 /致瘤率很低 (其它 3株MDCK细胞的致癌 /致瘤率为 5 / 5 4 ) ,且一般致上皮源性恶性肿瘤 ,多为高中分化腺癌。冻融裂解癌细胞系 (X株Hela、JA株Vero、M株BHK 2 1、YA株MD CK)的致癌 /致瘤性相应降低 ,极低致癌 /致瘤性细胞系 (M株或JC株MDCK)不会因冻融裂解而增加致癌 /致瘤性。证明MDCK细胞系冻融裂解物不致癌 ,降低制苗毒液中细胞系基因含量 ,完全可以将MDCK细胞系 (M ,JB ,JC株 )用于犬五联苗生产。MDCK细胞?

狐脑炎犬肾传代细胞弱毒苗的研制和应用

采用A 72细胞复壮CAV—2弱毒、CK细胞培养病毒的方法,成功地研制出狐脑炎犬肾传代细胞弱毒苗。经安全试验、效力试验、免疫期试验等证明,该苗不仅制造工艺简单、纯度高、安全可靠,而且免疫原性好、免疫期长,能有效地预防狐脑炎。

犬细小病毒YBYJ株体外诱导MDCK宿主细胞凋亡的研究

为研究犬细小病毒(CPV)在体外能否诱导MDCK宿主细胞凋亡,本研究应用前期分离到的CPV YBYJ强毒株接种MDCK细胞,通过倒置显微镜观察CPV导致MDCK宿主细胞病变(CPE)情况,采用细胞凋亡DNA Ladder抽提试剂盒和Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒和Caspase-3活性检测试剂盒检测,观察CPV诱导MDCK宿主细胞凋亡情况。结果显示,CPV YBYJ强毒株可导致MDCK宿主细胞产生明显CPE,并出现明显的DNA Ladder,Annexin V-FITC/PI双染为阳性,Caspase-3活性显著升高,提示CPV在体外能够诱导MDCK宿主细胞凋亡。

细胞凋亡在庆大霉素致MDCK细胞急性肾损伤中的作用

为了探讨细胞凋亡在急性肾损伤中的作用,试验以庆大霉素处理的MDCK细胞为急性肾损伤细胞模型,利用cck-8测定细胞活性,ELISA法检测肾脏损伤因子KIM-1和NGAL水平,Westernblot检测Bax、Bcl-2蛋白表达水平。结果表明：随着庆大霉素浓度的增加和时间的延长,与对照组相比,细胞活性呈显著或极显著下降（P〈0.05或P〈0.01）;细胞上清液中KIM-1含量随着庆大霉素浓度的增加呈显著或极显著上升趋势（P〈0.05或P〈0.01）,而NGAL含量随着庆大霉素浓度的增加呈先上升后下降的趋势,但无统计学意义;随着庆大霉素浓度的增加和时间的延长,Bax蛋白表达水平逐渐增加,Bcl-2蛋白表达水平逐渐降低。说明细胞凋亡在急性肾损伤中扮演着重要角色。

钙调素拮抗剂三氟拉嗪对犬肾上皮细胞增殖的影响

为探讨钙调素拮抗剂三氟拉嗪(TFP)对犬肾上皮细胞(MDCK)增殖的抑制作用及对细胞各周期时相的影响,采用细胞计数法、流式细胞术、[γ-32P]ATP掺入外源性底物的液体闪烁法和免疫组化技术,分别测定5、10和15μmol/L浓度的TFP对MDCK细胞增殖的抑制作用、细胞各周期时相的百分率、胸苷激酶(TK)的活性以及增殖细胞核抗原(PCNA)表达的阳性率。结果表明:给药3 d后,各浓度TFP对MDCK细胞生长均具有明显抑制作用;G0/G1期的细胞比率均显著增加(P<0.05),而S期、G2/M期细胞的比率则有所下降,其中高浓度TFP组显著下降(P<0.05);细胞内TK的活性和PCNA的表达显著降低,呈明显的时间剂量效应关系。说明TFP可通过阻断钙调素信号通路,影响DNA合成和细胞周期而抑制MDCK细胞的增殖。

犬五联病毒活疫苗制备用犬肾细胞系的建库筛选与检定

以人类子宫颈癌细胞系Hela为阳性对照 ,以连传 3代的犬、猫肾原代细胞 (CKC、FKC)作为阴性对照 ,对来自国内外不同单位收集的另外 4株MDCK传代细胞系培养 2 5～ 6 7代的完整活细胞进行裸鼠致癌 /致瘤实验观察 ,筛选出致癌性极低、符合细胞遗传学要求、无传染因子污染的 2株MDCK细胞系用于制苗 ,并建立了相应的细胞种子库和工作库 ,供科研和生产使用 ,4年运转很好。不同代次MDCK细胞系染色体众数所占比率的相差率一般不超过 5 %～ 15 % ,结构畸变率一般为 0～ 3%。研究表明 ,MDCK细胞染色体遗传特征决定致瘤性质 ,并具有种属特异性 ,MD CK细胞不论核型如何 ,始终具有致癌性 ,但其致癌 /致瘤性差 (2 3/ 5 9) ,且一般致上皮源性恶性肿瘤 ,多为高中分化腺癌。降低制苗毒液中细胞系基因含量 ,完全可以将MDCK细胞系 (WB和H株 )用于犬五联苗生产。MDCK细胞超二倍体YB株和亚二倍体与超二倍体KA株不能用作病毒活疫苗培养基质。找出了MDCK细胞系的染色体变异率、软琼脂中克隆形成率、对植物凝集素的凝集性和在裸鼠体内形成癌肿的潜力之间的可能相关性 ,发现细胞系染色体数目增加、克隆形成率增高、凝集性增强 ,则致癌

犬细小病毒在乳猫肾细胞中的增殖动态

犬细小病毒可在乳猫肾细胞内增殖．感染细胞培养液中病毒血凝滴度呈增长趋势，用生物素－亲和素酶间接染色法观察细胞在感染后１４小时．胞核中即可出现特异性染色．至７２小时胞核染色明显，有的细胞在包浆中亦出现特异性染色，此时感染细胞培养液可出现血凝现象．当胞浆染色明显时．病毒血凝滴度也增高．至感染晚期，胞核几乎空染，围绕胞核有一深色胞浆区，此时培养液的血凝滴度明显升高，两种方法所得结果相互印证．

二维液相色谱-质谱法研究犬肾小管上皮细胞脂质组成及马兜铃酸(Ⅰ)对其影响

采用在线正反相二维液相色谱-质谱联用技术研究了犬肾小管上皮细胞脂质组成及马兜铃酸（Ⅰ）对其影响。二维色谱的第一维用于分离不同种类脂质,第二维用于分离同类脂质的不同分子,进而利用高分辨质谱对脂质分子进行检测。该方法减少了共流出,降低了电离抑制,提高了灵敏度与准确性。借助精确质荷比检索数据库、高分辨二级质谱和当量碳数与保留时间规律等方法检测了犬肾小管上皮细胞中13类脂质的1 416个脂质分子。选取11种外源性脂质标准品进行方法验证,方法的线性关系、检测限、重复性均满足检测要求。在此基础上,考察了犬肾小管上皮细胞暴露于马兜铃酸（Ⅰ）后的脂质变化情况,对改变含量2~4倍的15个脂质分子进行了鉴定。该实验结果可为马兜铃酸的毒理、病理研究和相关疾病的临床诊断提供丰富的信息,并展现了二维液相色谱-质谱法在脂质组学研究中广阔的应用前景。

犬肾细胞癌晚期病例

肾细胞癌（renalcellcarcinoma，RCC），病因起源于肾脏的肾小管或集合管的上皮细胞，并且具有不同的病理类型。目前对于其发病原因还不十分明确，所以缺少早期警示，临床明显期有不同的临床症状表现。该病在小动物临床上极为罕见，笔者在本院收治1例，报告如下。

犬肾（DK）传代细胞中霉形体的分离与鉴定

取经电镜观察证实有霉形体污染的ＤＫ传代细胞，分别接种于霉形体检验用液体、半流体和固体培养基，证明为霉形体混合感染，即该培养物在液体培养基和半流体培养基上，同时显示出水解精氨酸和发酵葡萄糖２种特性，前者使培养基ｐＨ上升，后者使ｐＨ下降。通过反复挑选单个菌落进行克隆传代和有目的地加入单一种属的霉形体抗血清的方法，将混合的２株霉形体纯化分开。经鉴定，一株为精氨酸霉形体，一株为莱氏无（需）胆甾醇霉形体。

番茄红素对赭曲霉毒素A诱导犬肾小管上皮细胞毒性损伤的缓解作用

[目的]本试验以犬肾小管上皮细胞(Madin-Daby canine kidney cell,MDCK)为模型,研究赭曲霉毒素A(OTA)对MDCK的毒性作用以及番茄红素(lycopene,LYC)对细胞损伤的缓解效应。[方法]将对数生长期MDCK,随机分为对照组(无添加)、OTA组(15μmol·L^(-1) OTA)、LYC组(55μmol·L^(-1) LYC)、O+L组(15μmol·L^(-1) OTA+55μmol·L^(-1) LYC),处理36 h,研究OTA对MDCK细胞结构、细胞凋亡、肾功能相关指标、氧化与抗氧化、炎性因子等指标的影响,并探讨LYC在OTA致MDCK损伤中的缓解作用。[结果]OTA作用导致细胞发生明显皱缩,细胞数量骤减;电镜结果显示OTA能够导致细胞膜破裂、细胞器出现不同程度损伤,MDCK中乳酸脱氢酶(LDH)、活性氧(ROS)水平与丙二醛(MDA)含量极显著增加(P<0.01),超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性极显著降低(P<0.01);细胞中肾功能相关指标N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、β2-微球蛋白(β2-MG)、肝脏型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)、肾损伤分子1(KIM-1)、视黄醇结合蛋白(RBP)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)均极显著升高(P<0.01);同时极显著增加了MDCK的肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素6(IL-6)、干扰素18(IL-18)及干扰素1β(IL-1β)的水平(P<0.01);OTA可诱导MDCK凋亡率极显著升高(P<0.01);而LYC能够有效减缓OTA造成的损伤,LYC组与OTA处理组相比形态较饱满,细胞间衔接紧密,细胞凋亡率显著下降;LDH、ROS、MDA水平(含量)降低,SOD、CAT、GSH-Px活性升高,并降低炎性细胞因子的表达。[结论]OTA能够抑制MDCK活性,改变细胞形态,导致肾功能指标、氧化与抗氧化功能与细胞炎性因子异常,加快细胞凋亡;LYC能够显著缓解OTA对MDCK的损伤。

犬肾传代细胞与犬肺巨噬细胞杂合体的获得与鉴定

通过细胞融合技术获得了１３个犬肾传代细胞（ＭＤＣＫ）与大肺巨噬细胞（ＤＬＭ）杂合细胞株，其中２株（分别命名为ｋＭＨ—１和ｋＭＨ—２）对犬瘟热病毒（ＣＤＶ）强毒敏感。对ＫＭＨ—１鉴定结果表明该细胞在外观上与亲本细胞ＭＤＣＫ相似，呈现上皮细胞样形态，２５世代细胞在２４～１４４小时之间为对数生长期，群体倍增时间为２３．６小时，染色体众数为７７条，呈现近二倍体样核型。该细胞对ＣＤＶ强毒和弱毒敏感，并产生典型的多核巨细胞样细胞病变（ＣＰＥ），同时也能支持传染性犬肝炎病毒（ＩＣＨＶ）的增殖，产生而萄串样ＣＰＥ，说明杂合细胞ｋＭＨ—１保留了双亲细胞的遗传特性，经传到７８代仍保持低代次细胞特性。

1例犬肾细胞癌的诊断与手术治疗

犬肾细胞癌是犬泌尿系统较常见的肿瘤病之一,多为恶性。本文介绍了1例9岁患犬出现血尿症状,通过临床检查、实验室血液检查、影像学检查及组织病理学检查确诊为犬肾细胞癌。根据病症,通过手术实施了右侧肾脏摘除术,术后预后良好,6个月内未发现异常。