东北虎感染犬腺病毒Ⅰ型病例分析

2018年9月5日,吉林省野生动物救护繁育中心发生1例自繁自养的东北虎感染犬腺病毒Ⅰ型病例。该病例从发病到死亡病程较长,以食欲下降至废绝,饮水量降低,精神萎靡不振,呕吐,眼窝凹陷为特征。剖检发现,肝脏颜色暗黑,肾脏肿大,脾脏肿大,胃部有出血,牙龈及口腔色泽苍白无血色。临床血液生理生化指标检测显示,此虎贫血,肝、肾功能损伤。通过试纸条检测确诊感染犬腺病毒Ⅰ型病毒。

犬腺病毒Ⅰ型和Ⅱ型Taq Man双重荧光定量PCR方法的建立

为鉴别检测犬腺病毒(CAV)Ⅰ型和Ⅱ型,根据GenBank中CAV-I和CAV-II型参考基因序列,设计合成1对通用引物和2条鉴别探针,建立了可鉴别检测CAV-Ⅰ型和CAV-Ⅱ型的双重荧光定量PCR检测方法。同时,对该方法进行了优化,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行了试验,并与普通PCR检测方法进行样品检测符合率分析。特异性试验结果显示;本研究建立方法对犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬冠状病毒均未产生扩增曲线。敏感性试验结果显示,建立方法对CAV-Ⅰ的检测敏感度为100copies/μL,对CAV-Ⅱ的检测敏感度为10copies/μL。重复性试验结果显示,组内和组间变异系数均小于5%。临床样品检测对比结果显示,建立方法与普通PCR方法的符合率为95.12%。结果表明,本研究建立的TaqMan双重荧光定量PCR方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好等优点,可用于临床鉴别检测CAV-Ⅰ和CAV-Ⅱ型。本研究为CAV-I和CAV-II型感染的检测、鉴别以及流行病学调查提供了便捷快速的方法。

犬细小病毒、犬腺病毒Ⅰ型和犬腺病毒Ⅱ型三联PCR诊断方法的建立

旨在建立可同时检测犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)、犬腺病毒I型(canine adenovirus typeⅠ,CAV-Ⅰ)和犬腺病毒Ⅱ型(canine adenovirus typeⅡ,CAV-Ⅱ)的PCR诊断方法,分别将3种病毒基因组序列进行同源性比对,选择高同源区段,应用Primer Primier 5.0计算机软件设计并合成了2对特异性扩增引物,目的片段大小分别为670 bp(CPV)、497 bp(CAV-Ⅰ)和1019 bp(CAV-Ⅱ)。分别提取CPV、CAV-Ⅰ和CAV-Ⅱ细胞培养物的DNA,进行三联PCR扩增试验。结果表明,所建立的单项PCR及二联PCR扩增良好,其产物经测序比对与引物扩增序列完全一致。在此基础上,优化三联PCR扩增试验条件,成功建立了可同时检测CPV、CAV-Ⅰ和CAV-Ⅱ的三联PCR诊断方法。并对其特异性和灵敏度进行检测,三联PCR最低检测限度为0.16 pg总DNA,而对犬副流感病毒和犬瘟热病毒的PCR检测结果均为阴性。对送检的20份病料进行检测,结果显示15份为CPV阳性,5份为CAV-Ⅰ阳性,1份为CAV-Ⅱ阳性。

犬Ⅰ型腺病毒TN株的分离鉴定

应用 MDCK细胞采用单层吸附接毒和带毒传代的方法 ,从新疆阿克苏送检的犬粪便中分离出 1株犬腺病毒 ,并对其进行了形态学、理化学、血清学、动物感染试验、分子生物学鉴定。结果证明所分离的 TN株为 1株CAV-

貉源犬腺病毒Ⅰ型的分离鉴定及生物学特性分析

用MDCK细胞从患病貉的临床样品中分离出1株病毒,并采用PCR、测序分析、免疫荧光试验、血凝试验和理化特性试验进行鉴定。结果显示:PCR扩增得到500 bp条带,其核苷酸序列与犬腺病毒Ⅰ型(CAV-1)同源性为93.2%~98.7%,而与CAV-2同源性仅为55.3%;接种该病毒的MDCK细胞出现了"葡萄串样"细胞病变(CPE),且胞核中有特异性亮绿色荧光;病毒滴度为1×10^7.4TCID50/m L;该病毒可以凝集人O型红细胞和豚鼠红细胞;对FUDR敏感,对乙醚、热、酸有一定的抵抗力。以上结果表明,本研究分离的病毒为貉源CAV-1。为了解CAV-1对貉的致病性和疫苗开发提供了依据。

犬Ⅰ型腺病毒荧光定量PCR检测方法的建立

通过分析对比GenBank公布的几株犬Ⅰ型腺病毒序列,针对犬Ⅰ型腺病毒特有的E3区,设计了1对特异性引物。对引物浓度、退火温度、扩增体系等条件优化后,建立了犬Ⅰ型腺病毒荧光定量PCR检测方法,并对40份CAV-Ⅰ人工感染银黑狐的粪便样品进行了检测。结果表明,与普通PCR相比,建立的犬Ⅰ型腺病毒荧光定量PCR检测方法具有特异性好、灵敏度高、重复性强的特点。该检测方法可用于Ⅰ型犬腺病毒的快速诊断与监测,并能够定量分析CAV-Ⅰ的感染程度。

犬Ⅰ型腺病毒结构蛋白Knob的可溶性表达及免疫原性研究

为了探究犬Ⅰ型腺病毒(Canineadenovirus type1,CAdV-1)F1301株结构蛋白Knob的免疫原性,试验采用原核表达技术将Knob蛋白基因克隆到pColdⅡ原核表达载体中进行低温诱导,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中实现可溶性表达。利用纯化后的重组蛋白Knob免疫Balb/c小鼠,监测免疫后小鼠血清中重组蛋白Knob特异性抗体ELISA效价、病毒中和抗体效价,测定脾脏T淋巴细胞增殖活性,研究重组蛋白Knob的免疫原性。结果表明:表达的重组蛋白Knob为可溶性蛋白,分子质量约为20ku。第2次免疫后7,14天,试验组小鼠血清ELISA抗体效价分别为1∶6400和1∶3200,中和抗体效价分别为1∶118和1∶96。第2次免疫后7天,试验组小鼠T淋巴细胞增殖指数为1.322,显著高于对照组(P<0.05)。说明试验成功表达出CAdV-1重组蛋白Knob,所表达的重组蛋白Knob具有良好的免疫原性且存在CAdV-1的中和抗原表位。

犬Ⅰ型腺病毒Ⅸ蛋白的生物信息学分析

为了探究犬Ⅰ型腺病毒(CAdV-1)Ⅸ蛋白的理化性质、空间结构与抗原位点,试验以中国农业科学院特产研究所宠物生物制品研发团队实验室分离毒株的Ⅸ蛋白氨基酸序列为研究对象,采用生物信息学方法,利用ProtParam tool、NetPhos 3.1 Server、TMHMM、PSIPRED、SOPMA、Phyre 2和IEDB等在线网站对Ⅸ蛋白的理化性质、磷酸化位点、糖基化位点、跨膜区、信号肽、二级结构、三级结构、抗原决定簇和B细胞抗原决定簇进行预测。结果表明:Ⅸ蛋白含有71个氨基酸,平均吸水系数为-0.399,等电点为9.86。α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占16.90%、35.21%、9.85%和38.03%。Ⅸ蛋白不存在跨膜区和信号肽,存在2个潜在蛋白质抗原决定簇、5个蛋白质磷酸化位点,潜在B细胞抗原决定簇为18~31位。说明本试验初步预测分析得到CAdV-1Ⅸ蛋白的理化性质和抗原决定簇,可为CAdV-1Ⅸ蛋白的分离、提纯提供参考依据,同时为进一步研制基于Ⅸ蛋白的亚单位疫苗提供前期基础。

狐源犬Ⅰ型腺病毒分离与鉴定

在研究山东地区狐狸传染性脑炎流行情况的过程中,从潍坊某养狐场送检的9份疑似狐狸传染性脑炎病死狐脏器中分离到一株病毒。对所分离到的病毒进行形态学观察、病毒核酸型鉴定、特异性试验、PCR检测及动物感染试验的系统鉴定,并通过耐热性试验,耐酸性试验,脂溶剂敏感试验,血凝实验对其主要生物学特性进行研究,试验结果显示该病毒能在DK细胞中生长,引起"葡萄串样"细胞病变效应(CPE),抗犬Ⅰ型腺病毒抗体能够特异性地抑制所分离病毒在DK细胞内的增殖。形态为20面体立体对称、直径约80nm的腺病毒样粒子,对5-IUDR敏感,对56℃、pH3.0的酸、氯仿有一定抵抗力,能凝集鸡、豚鼠和人O型红细胞,用E3区特异性引物能扩增出CAV-1特异性核酸片段,能感染狐狸引起狐狸传染性脑炎症状。结果表明所分离到的病毒为犬Ⅰ型腺病毒(Canine adenovirus type 1,CAV-1),将其命名为CAV-1-FOX/WF株。

犬Ⅰ型腺病毒E1A蛋白的生物信息学分析

为进一步了解犬Ⅰ型腺病毒,并深入探究E1A蛋白的基本结构,为CAdV-Ⅰ的研究奠定基础。该研究利用Protparam、ProtScale、SignalP 5.0 Server和TMHMMServer 2.0等在线服务器对E1A蛋白的理化性质、信号肽和二级及三级结构等进行预测。结果发现,E1A蛋白氨基酸数量为225个;等电点为11.86,带正电荷氨基酸残基数和带负电荷氨基酸残基数分别为36和2;E1A蛋白为有跨膜结构、疏水性蛋白、无信号肽、无糖基化位点、含有9个丝氨酸磷酸化位点,10个苏氨酸磷酸化位点,不存在酪氨酸磷酸化位点;-螺旋和无规则卷曲结构是E1A蛋白的二级结构中最主要的元件,可信度为19.0%,蛋白覆盖率为9%,有6个抗原决定簇。以上结果有利于进一步开展E1A蛋白的研究,为建立CAdV-Ⅰ的抗体检测方法和亚单位疫苗提供了基础。该研究运用生物信息学分析方法预测E1A蛋白,但生物信息学是在已有知识基础上的预测,所以未来还需要对此进行进一步研究探讨。

犬传染性肝炎病毒Hexon蛋白Loop1、Loop2基因的克隆与表达

腺病毒主要的中和抗原表位位于六邻体蛋白Loop1、Loop2上,目前的研究主要集中在人腺病毒,犬传染性肝炎病毒(即犬腺病毒Ⅰ型)尚未见报道。参考Genebank发表的基因序列设计引物,提取ICHV基因组DNA,,分别PCR扩增六邻体蛋白(Hexon)的Loop1、Loop2基因片段,用T4酶连接在一起,克隆入原核表达载体pET28a中,测序显示保存病毒分离株Loop1与CLL株、RI261株和Toronto A26/61株核苷酸序列同源性分别为100%、100%和83.8%;Loop2与CLL株、RI261株和Toronto A26/61株核苷酸序列同源性分别为88.1%、88.1%和99.3%,推导的氨基酸序列同源性分别为93.6%、93.6%和98.6%。转化BL21工程菌,实现了重组Loop蛋白在大肠杆菌中的高效表达,分子量约为36kDa,并且利用镍柱纯化重组蛋白,纯度达95%以上。用重组蛋白免疫BALB/c小鼠后,以间接ELISA法测定血清抗病毒抗体效价达1320以上,western blot鉴定免疫血清与ICHV特异性结合。该实验为建立新的犬传染性肝炎病毒基因工程产品奠定了良好的基础。

用PCR技术鉴定犬传染性肝炎病毒强、弱毒株的研究

根据Genebank中发表的犬传染性肝炎病毒 (ICHV)标准强毒株Glaxo和人工驯化的弱毒疫苗株CLL的保守序列间大小不同 ,按照引物设计的原则 ,设计合成了一对通用引物。该对引物可由ICHV强毒株扩增出 569bp的片段 ,而弱毒株可扩增出 2 4 4bp的片段。对PCR产物分别进行电泳、酶切和测序 ,证明PCR产物片段大小、酶切位点和核苷酸序列与设计的产物完全一致。正常DK细胞上清和犬传染性喉气管炎病毒 (CAV 2 )强、弱毒株细胞培养物均不能被该引物扩增 ,说明具有良好的特异性。其检测到的病毒量分别为 1 5TCID50 、 31TCID50 、说明该技术具有很高的敏感性。可用于ICHV强。