犬1型腺病毒诊断方法研究进展

犬1型腺病毒(Canine adenovirus 1,CAdV-1)是一种主要感染犬科动物,并可引起传染性肝炎的重要病原,CAdV-1的诊断研究一直是兽医学领域的研究热点。目前已经有多种方法用于检测CAdV-1,包括病毒分离鉴定、血清学和PCR检测等。其中,PCR检测具有较高的灵敏度和特异性,已成为最常用的检测方法之一。因此,通过血清学、病原学和分子生物学三方面综述CAdV-1诊断方法的研究进展,为开发CAdV-1防控新产品提供参考。

犬腺病毒1型感染普通级比格犬中Ⅰ和Ⅲ型干扰素及其受体分子表达量的比较

比较普通级比格犬感染犬腺病毒1型(CAV-1)后外周血和肝内Ⅰ型和Ⅲ型干扰素(IFN)及其受体分子的转录水平,同时评估CAV-2疫苗免疫对CAV-1感染试验的影响。对3只2月龄普通级比格犬后肢肌肉注射105.7TCID50CAV-1纯化病毒,在攻毒后12 d内记录体温变化,每日采集咽拭子和肛拭子,于攻毒后第3、6、9、12天采集前腔静脉血,利用常规PCR检测CAV-1和CAV-2核酸,利用间接免疫荧光试验(IFA)检测血清抗体效价。攻毒后第12天进行安乐死,采集心脏血和肝,利用定量PCR法检测血液和肝中IFN-α、IFN-β、IFNβR、IFN-λ1、IFNλ1R、IFNλ3和IFNλ3R等的转录水平。结果显示,31#犬的体温次日即升至39.7℃,出现便血和轻度腹泻,攻毒后第3天外周血中病毒核酸拷贝数达到峰值,随后在胸腺、腹股沟淋巴结、颌下淋巴结、肠系膜淋巴结和肝等组织中检测到CAV-1核酸,攻毒后第12天肝中IFN-λ1R的转录水平显著高于其他分子,IFA效价为1∶320。34#犬和35#犬的体温变化、临床症状、病毒血症、血清抗体效价和干扰素表达量均低于31#犬。实验早期犬的咽拭子和肛拭子中均检测到不同含量的CAV-2核酸。结果表明,CAV-1感染犬血液中的Ⅰ型和Ⅲ型干扰素表达规律不明显,肝是IFN-λ1主要的效应器官,同时CAV-2疫苗免疫对普通级实验犬的CAV-1感染研究具有一定的干扰。

犬腺病毒1型对犬北极狐和银狐的致病性比较

为比较本实验室保存的狐源犬腺病毒1型(CAdV-1)对犬、北极狐和银狐的致病性,以犬、北极狐和银狐为实验动物,建立3组CAdV-1 F1301株的感染模型。攻毒后监测各组动物的临床症状,并计算CAdV-1对这3种动物的半数致死量(LD_(50)),收集感染致死动物的脏器组织,采用病理组织观察、免疫组织化学试验和实时荧光定量PCR等方法比较CAdV-1对犬、北极狐和银狐的致病性。结果显示,3组实验动物均出现神经症状,CAdV-1对犬、北极狐和银狐的LD50分别为106.5T CID50、105.5TCID50和103.0TCID50。病理组织观察和免疫组织化学试验结果显示,3组动物的肝均出现较严重的病理损伤,且均呈CAdV-1强阳性,银狐的脾、北极狐的肺和脾均呈CAdV-1阳性。荧光定量PCR结果显示,3组动物肝中均检测到高拷贝数的病毒DNA,其中银狐肝中的病毒DNA载量高达10^(8.83)copies/g,显著高于北极狐(P<0.05)和犬(P<0.01),银狐脑组织中的病毒DNA载量也显著高于北极狐(P<0.01)和犬(P<0.01)。结果表明针对CAdV-1,银狐的易感性大于北极狐,北极狐的易感性大于犬;CAdV-1对3组动物的主要靶器官为肝,银狐的脾和脑以及北极狐的脾和肺也为CAdV-1感染的重要靶器官。本研究为CAdV-1的病理学诊断和综合防控提供了参考。

犬腺病毒 1型疫苗株 E3缺失表达载体的构建

探索以犬腺病毒 1型疫苗株 (Cannaught Laboratory Limited, CLL)作为病毒重组疫苗和基因转移载体的可行性。方法构建带增强型绿色荧光蛋白（ enhanced green fluorescent protein, EGFP）报告基因的 E3缺失重组病毒 CLLEGFP。将 CLLEGFP感染各种人源细胞，并以灌胃、腹腔注射、尾静脉注射和肌肉注射等不同途径接种昆明小鼠。多时间点取小鼠组织标本，冷冻干燥切片，观察 EGFP的表达。 4周后采集小鼠血清，以 Western blot分析抗 EGFP抗体的产生。结果 CLLEGFP能够感染各种人源细胞并表达 EGFP。在腹腔接种 CLLEGFP 3 d的小鼠肝组织细胞中可见转导的 EGFP。 Western blot分析显示，以各种途径免疫接种重组病毒 4周后的小鼠血清中均存在抗 EGFP特异抗体。结论 CLL具有开发成为病毒重组疫苗和基因转移载体的潜力。

犬腺病毒Ⅰ型流行毒株的分离与鉴定

目的 分离、鉴定犬腺病毒 型流行毒株 .方法 将处理过的病犬肝组织悬液 ,感染原代犬胎肾细胞 .用血凝试验、中和试验、回归试验以及电镜观察等方法 ,分离、鉴定 .结果 分离出一株犬腺病毒 型流行毒株 ,命名为 CAV1 -XN3株 .

犬1型腺病毒E1B-55K蛋白的结构预测及分析

犬1型腺病毒E1区包括E1A、E1B-55K和E1B-19K。为了研究E1B-55K可延缓细胞过早凋亡,并协助mRNA翻译的作用。本文采用生物信息学方法预测E1B-55K蛋白的理化性质、亲疏水性、跨膜区结构、二级及三级结构、磷酸化及糖基化位点和抗原表位,并分析其结构和功能。结果发现E1B-55K有424个氨基酸,原子组成为C2199H3535N575O538S39,分子量为47887.13,带负电与正电的氨基酸残基总数分别为25和46个,不稳定指数为42.53。E1B-55K蛋白有23个磷酸化位点。只有1个糖基化位点位于第64位。E1B-55K是平均亲水系数为0.662的疏水蛋白,无信号肽和跨膜区结构。二级结构中折叠占12.50%、螺旋占38.68%、无规卷曲和延伸链分别为23.58%和25.24%。在三级结构中获得E1B-55K蛋白的可信度和覆盖率分别为38.6%和2%。有17个抗原决定簇和45个优势的B细胞抗原表位存在于E1B-55K蛋白中。从而得出预测E1B-55K蛋白的性质、结构和功能有助于建立基于E1B-55K的ELISA检测方法和亚单位疫苗的结论。

犬腺病毒间接免疫荧光检测方法的建立

用犬腺病毒制作的抗原玻片,通过确定最佳一抗和荧光抗体浓度,特异性试验和敏感性试验,建立了犬腺病毒间接免疫荧光方法,可用于狐狸脑炎的诊断。

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白-重组犬1型腺病毒构建及在猪体内免疫特性

本试验根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）基因组GP5蛋白的免疫原性，将PRRSV河北分离株GP5基因的表达盒克隆到犬1型腺病毒的感染性基因组的复制非必需区内，转染MDCK细胞，获得了重组病毒，免疫新生仔猪，分别在免疫后O～12周采集血清，通过ELISA检测证明，猪体同时产生了针对犬1型腺病毒和PRRSV GP5的抗体。说明GP5-重组犬1型腺病毒具有作为蓝耳病疫苗的潜力。