犬贾第虫纯培养的建立

将取自一1岁自然感染犬贾第虫的雌性、德国牧羊犬的包囊利用蔗糖密度梯度离心-G1耐酸漏斗滤过法进行分离和纯化,经口感染给10日龄的沙鼠幼鼠,8 d后无菌取其小肠上段,分离出滋养体,转入改良TYS-I-33培养基中进行培养,在驯化5个月之后,虫体逐渐适应了培养环境,在管壁上形成了细胞单层并进行传代,每隔48～72 h传代1次,共传18代.将培养物置肉汤及血琼脂平板培养,未见细菌及霉菌污染,为纯培养.

犬贾第虫携病毒株体外纯培养的建立

目的培养一携带犬贾第虫病毒的犬贾第虫(Giardiacanis)细胞株。方法用蔗糖密度梯度离心-G1耐酸漏斗过滤法纯化犬贾第虫包囊,经口接种5日龄长爪沙鼠(Merionesunguiculata),8d后于其十二指肠无菌收集犬贾第虫滋养体,置改良的TYI-S-33培养基中培养,待滋养体在培养管壁上形成细胞单层后进行传代。同时进行冻存和复苏实验,以及纯度、稳定性、细胞生物学特性、微生物污染等4项指标检测。滋养体经液氮冻融3次后3000×g离心15min,取上清,用磷钨酸负染,透射电镜观察病毒粒子。结果犬贾第虫滋养体接种14d后虫体逐渐适应了培养环境,在培养管壁上形成细胞单层,经上述4项指标检测,证明形成了稳定的犬贾第虫细胞株。电镜观察,见滋养体内有外观球形呈20面体结构、直径约为36nm的病毒样粒子。结论建立了携带GCV的犬贾第虫细胞株的体外纯培养。

犬贾第虫dsRNA病毒的鉴定及特性

对分离到的 6株犬贾第虫 ( Giardia canis)包囊进行核酸分析 ,在其中 1株犬贾第虫核酸的琼脂糖凝胶电泳图谱上观察到 1条长度约 7.0 kb的片段。经鉴定 ,该核酸不能被 DNA酶 ( 1 0 0 mg/ L)降解 ,对质量浓度低的 RNA酶 ( 0 .1 mg/ L)不敏感 ,但可被质量浓度高的 RNA酶 ( 1 0 mg/ L)降解。纯化包囊经液氮冻融后 ,磷钨酸负染 ,电镜观察发现有球形、直径约为 33nm的病毒样粒子存在 ,包囊超薄切片在胞质中也观察到该病毒样粒子存在。RNA依赖 RNA聚合酶活性测定结果表明 ,该病毒具有 RNA依赖 RNA聚合酶的活性。犬贾第虫 ds RNA病毒核酸经 RT-PCR扩增后得到 1条预计扩增大小的片段 ,将其回收后连接到 p MD1 8-T载体上进行克隆并测序 。

犬贾第虫病毒转染载体介导的绿色荧光蛋白在犬贾第虫体内的表达

目的构建犬贾第虫病毒(Giardia canis virus,GCV)转染载体。方法根据GCV基因组(DQ238861)的转录起始位点、复制起始位点及包装位点的序列特征和表达外源基因的顺式作用元件,将绿色荧光蛋白(GFP)基因替换GCV基因部分编码区,构建GCV基因与GFP基因的嵌合体,并置T7启动子之下。用T7 RNA聚合酶体外转录后经电穿孔转染犬贾第虫滋养体,并用荧光显微镜检测GFP表达情况,间接ELISA测定转染后GFP的表达量。结果构建了犬贾第虫病毒重组质粒pGCV634/GFP/GCV2174,经SacⅠ和NotⅠ双酶切得到约2.0和3.5 kb两条带,与预计值相符。由其介导的绿色荧光蛋白在犬贾第虫体内得到了高效表达,其表达量在转染后第1天达高峰(A490=1.8);以后随时间的延长而逐渐下降,14 d后绿色荧光信号基本消失。结论成功构建了犬贾第虫病毒转染载体,为贾第虫细胞基因表达调控的研究提供了方法。

犬贾第虫病毒(长春株)全基因组序列分析

根据已报道的人源蓝氏贾第虫病毒序列设计了互相重叠的6对特异性引物,以犬贾第虫(长春株)纯培养滋养体总核酸为模板进行RT-PCR。PCR产物连接到pMD18-T载体进行测序,通过BLAST在GenBank进行同源性搜索,并用DNAMAN分子生物学软件进行分析。结果测得我国犬贾第虫病毒(长春株)基因组全长为6 276bp(DQ238861),编码1个有887个氨基酸残基的衣壳蛋白和1 056个氨基酸残基的融合蛋白,这2个阅读框被-1核糖体移码框分开,重叠处有220 nt。基因组中G+C占49.62%。其序列与国外报道的人源蓝氏贾第虫病毒(L13218)序列同源性为94.62%,编码的氨基酸同源性为93.50%;与国内人源蓝氏贾第虫病毒(AF525216)序列同源性为98.88%,编码的氨基酸同源性为98.30%。

犬贾第虫病毒转染载体介导的锤头状核酶对KRR1基因体外转录体切割效果的研究

目的检测犬贾第虫病毒介导的锤头状核酶对犬贾第虫滋养体核仁功能性蛋白KRR1基因体外转录体切割效率。方法将两端携带反义KRR1基因的锤头状核酶(ribozyme,R酶)插入犬贾第虫病毒(Giardia canis virus,GCV)转染载体中,构建两个核酶嵌合型犬贾第虫病毒载体:短反义序列,上游及下游均为21个碱基,形成重组质粒KRzS;长反义序列,上游为288个碱基,下游为507个碱基,形成重组质粒KRzL。另设两种阴性对照,即重组质粒TRzL(即R酶两端含虫体反义磷酸丙糖异构酶基因,上游为324个碱基,下游为380个碱基)和重组质粒PKR(即犬贾第虫病毒转染载体中仅有KRR1基因的反义片段而无R酶功能区)。应用荧光实时定量RT-PCR法检测嵌合型锤头状核酶体外对KRR1基因mRNA切割活性。结果KRzS、KRzL转录体对KRR1基因体外转录RNA切割效率分别达到74.0%和81.1%。而PKR对KRR1 mRNA反转录的影响较小,RT-PCR效率仅降低12.0%。TRzL对KRR1 mRNA反转录几乎无影响。结论犬贾第虫病毒介导的锤头状核酶对KRR1基因体外转录体能进行有效切割,为以后的体内锤头状核酶对KRR1基因表达抑制试验提供依据。

犬贾第虫感染的诊治

犬的贾第虫病是由犬贾第鞭毛虫寄生于犬小肠内引起腹泻的一类肠道原虫病。贾第虫具有人犬互传的可能性，人源和犬源贾第虫基因具有相似性，因此犬的贾第虫病已引起国外兽医的普遍重视。在国内因为贾第虫致病力弱、临床症状不明显加之国内检测手段的制约，对该病重视不足。临床上常会发生误诊、漏诊现象。笔者查阅国内外相关资料并结合自己的临床经验，对即墨一藏獒养殖场3窝幼犬同时爆发以持续下痢为主要症状的传染病确诊为贾第虫感染。

犬贾第虫核糖体16sRNA部分序列克隆及测定

目的 获取犬贾第虫核糖体 16sRNA基因序列。方法 从犬贾第虫包囊中 ,快速提取DNA ,并以DNA为模板 ,利用热启动PCR技术扩增出一 6 11bp的预计大小的基因片段 ,纯化回收后 ,与PMD18 T载体连接转化到DH5a大肠杆菌中 ,筛选到阳性克隆经PCR、EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定 ,并用双脱氧链末端终止法测定DNA序列 ,登陆BLAST进行同源性比较和分析。结果 获得了长度为 6 11bp的基因序列 ,并发现与犬贾第虫核糖体的同源性最高达 99%。结论 获得了犬贾第虫核糖体 16sRNA的部分基因序列 ,为研究其在核酸进化领域中的地位和PCR法快速诊断贾第虫病提供了理想的基因材料。

犬贾第虫MM/Sac-C/1基因的克隆及序列分析

利用PCR技术从犬贾第虫滋养中扩增出了2004bp大小的MM/Sac-C/1基因,构建了p MD-MM/Sac-C/1克隆载体,并进行了序列测定,利用计算机对该序列进行了核苷酸同源性比较.结果表明,与GeneBank登陆的蓝氏贾第虫WB株AF236019序列比较,其同源性为98%,蛋白质同源性比较结果显示,与蓝氏贾第虫WB株表面抗原的同源性为90%,获得了犬贾第虫MM/Sac-C/1基因.

犬贾第鞭毛虫α-12贾第素基因的原核表达及纯化

为了原核表达、纯化犬贾第鞭毛虫α-12贾第素蛋白,试验经RT-PCR获得α-12贾第素基因片段,克隆至原核表达载体p ET-28a(+),构建重组原核表达质粒p ET-28a-α-12,再转化入E.coli Rosetta(DE3)后,用IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经SDS-PAGE和Western-blot分析验证,并用Ni琼脂糖凝胶纯化融合的α-12贾第素蛋白。结果表明:重组原核表达质粒p ET-28a-α-12经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为40 ku,且主要以包涵体形式存在;表达量约占菌体总蛋白的15.7%;纯化的重组蛋白纯度达90%以上。

犬贾第虫病病例报告

犬贾第虫在犬的感染率较高,但国内临床确诊较少。笔者记录了2004年11月份2只西伯利亚雪橇犬经检查确诊为贾第虫感染,后经治疗痊愈的病例,并对犬贾第虫病的诊断、治疗进行了讨论。

犬贾第虫端粒重复序列的Southern印迹杂交分析

目的确定犬贾第虫端粒DNA的重复序列,为进行端粒酶活性检测奠定基础。方法根据已发表的蓝氏贾第虫的端粒重复序列5′-TAGGG-3′设计寡聚核苷酸探针(TAGGG)5,并以地高辛标记,将犬贾第虫基因组DNA经Bal31-EcoRⅠ酶切后,进行Southern印迹杂交分析。结果犬贾第虫基因组DNA与探针(TAGGG)5杂交,获得了较好的杂交条带,随Bal31酶切时间的延长,杂交信号逐渐减弱。结论犬贾第虫端粒重复序列定位在染色体的末端序列与国外报道的贾第虫端粒重复序列一致,为5′-TAGGG-3′。

以30日龄长爪沙鼠为介体建立犬贾第虫纯培养

将取自然感染犬贾第虫的德国牧羊犬的包囊利用蔗糖梯度离心-G1耐酸漏斗滤过法进行分离和纯化,经口感染给30日龄的沙鼠.8d后无菌取小肠上段,分离出滋养体,转入改良TYI-S-33培养基中37℃培养.72h后在管壁上形成了细胞单层,将培养物置肉汤及血琼脂平板培养,未见细菌及霉菌污染,为纯培养.

犬贾第虫体外诱导成囊形态学变化的观察

为观察犬贾第虫(Giardia canis)滋养体体外诱导成囊过程中的形态学变化,本实验采用TYI-S-33培养基体外纯培养G.canis滋养体,通过改良的TYI-S-33培养基诱导成囊,在0 h、24 h、48 h和72 h对虫体进行观察。结果显示:24 h后虫体开始变圆;48 h后可以观察到虫体鞭毛和吸盘消失,虫体表面出现囊膜分泌型小体,少量虫体被包囊壁包裹;72 h后成囊率最高可达50%。本研究为G.canis成囊方面的研究奠定了基础。

犬贾第虫端粒酶催化亚基基因的克隆及序列分析

目的对犬贾第虫端粒酶催化亚基(GcTERT)基因进行克隆及序列分析。方法根据人源贾第虫的端粒酶催化亚基TERT基因(AF195121)设计1对引物,以犬贾第虫滋养体总核酸为模板,扩增犬贾第虫端粒酶催化亚基(GcTERT)基因,PCR产物连接到PGEM-T载体并转化入DH5α感受态菌进行测序,通过BLAST对GenBank进行同源性搜索,并用分子生物学软件进行分析。结果测得犬贾第虫端粒酶催化亚基(GcTERT)基因全长2 883 bp,该基因序列与人源贾第虫的端粒酶催化亚基基因同源性为99%,氨基酸的同源性也为99%。结论成功扩增了犬贾第虫端粒酶催化亚基(GcTERT)基因,为进一步研究该基因的功能及筛选抗犬贾第虫药物靶标奠定了基础。

犬贾第虫包囊的分离与鉴定

从吉林省某犬繁育中心自然感染的比格犬中分离到一株贾第虫 ,经鉴定其为贾第虫属蓝氏贾第虫种犬贾第虫亚种 ,本研究提供了一套简便可行的犬贾第虫包囊的分离的分离纯化方法 ,将有利于对该病的进一步研究。

丙硫咪唑（肠虫清Albendazole）对犬贾第虫病（Giardiasis）的疗效

丙硫咪唑（肠虫清Ａｌｂｅｎｄａｚｏｌｅ）对犬贾第虫病（Ｇｉａｒｄｉａｓｉｓ）的疗效犬贾第虫（ＧｉａｒｄｉａＣａｎｉｓ）是常发现于犬只小肠内的一种原虫。该原虫可存在于整个小肠，但以十二指肠和空肠为最多量。目前可供犬只使用的杀贾第虫药物，有甲硝哒唑（ｍｅ...

犬贾第虫病的诊治

2007年3月,饲养的大白熊犬发生了贾第虫病,经实验室检查结合临床症状诊断为犬贾第虫病,经采取有效的综合防治措施很快控制了病情,1周后康复.

犬贾第虫病的诊疗体会

犬贾第虫病是由犬贾第虫寄生于肠道引起的一种人犬共患寄生虫病，各品种犬均易感染，严重威胁犬的健康，对管理人员的健康也构成一定的威胁。贾第虫病呈世界性分布，我国犬感染此病的比例较高，2000年3月在吉林省调查犬寄生虫感染情况时发现犬贾第虫感染率高达25．20％。大多数成年犬感染贾第虫后症状不明显，但幼犬症状较为明显，若不及时治疗，会影响幼犬的生长发育，甚至引起死亡。

犬贾第鞭毛虫PDI-4基因的表达及定位

目的克隆、表达二硫键异构酶4基因,并研究其在犬贾第鞭毛虫滋养体中的定位。方法根据GenBank登陆的贾第鞭毛虫二硫键异构酶4基因(gPDI-4)(登录号XM_001710176)序列,通过分析序列,设计合成一对gPDI-4引物。以犬贾第鞭毛虫滋养体总RNA为模板,采用反转录PCR的方法扩增PDI-4基因并克隆至pMD-18T载体,构建pMD-gPDI-4载体,再把目的基因亚克隆至pET-28a载体,构建表达载体pET-gPDI-4,转化入大肠埃希菌表达菌DE3中,经IPTG诱导后用SDS-PAGE分析表达情况。同时用组氨酸(His)结合树脂柱纯化PDI-4蛋白。用纯化的PDI-4蛋白免疫小鼠,之后收集血清作为一抗,通过免疫荧光法检测PDI-4在贾第鞭毛虫滋养体中的定位。结果反转录PCR(RT-PCR)扩增出大小为1 065bp的PDI-4基因,构建的pET-gPDI-4能高效表达gPDI-4蛋白,SDS-PAGE显示表达蛋白分子质量为36ku。免疫荧光试验显示贾第鞭毛虫PDI-4蛋白除定位于细胞表面、内质网和腹部吸盘外,主要存在于腹部鞭毛。结论成功克隆、表达了犬贾第鞭毛虫PDI-4基因,并确定其主要在腹鞭毛表达。