犬造血干细胞分离、鉴定和培养特性研究

【目的】研究骨髓来源的犬造血干细胞(cannie hematopoietic stem cells,cHSCs)的分离、鉴定和培养特性,建立体外培养最优条件,为临床应用奠定理论基础。【方法】取3月龄犬骨髓,采用Ficoll密度梯度离心法分离出单个核细胞(mononuclear cells,MNCs),通过流式细胞仪分选cHSCs并进行体外悬浮培养。用CCK-8法检测cHSCs在不同培养基、不同浓度胎牛血清(FBS)、不同细胞因子、不同cHSCs与cBMSCs接种比例条件下的细胞活性,筛选最优体外培养方案。使用台盼蓝染色计数法统计体外共培养1、7、14、21 d后cHSCs增殖情况。利用流式细胞术和实时荧光定量PCR分别检测P0、P1、P2和P3代cHSCs表面标志物CD34分子阳性百分比以及干性基因性别决定相关基因簇2(SOX2)和八聚体结合蛋白-4(OCT-4)的mRNA表达水平。【结果】成功分离获得cHSCs,不同培养基中细胞活性无显著差异(P>0.05);不同浓度FBS中,5%FBS组cHSCs活性显著低于10%、15%、20%FBS组(P<0.05),10%FBS组cHSCs活性显著低于20%FBS组(P<0.05);不同细胞因子条件下,TPO+FLT-3+SCF+IL-6组cHSCs活性显著高于TPO组和TPO+FLT-3组(P<0.05);不同cHSCs与cBMSCs接种比例条件下,1∶10组cHSCs活性极显著高于1∶5、5∶1和10∶1组(P<0.01),5∶1接种组cHSCs活性极显著高于1∶5和10∶1组(P<0.01)。通过筛选的最优培养方案进行体外共培养,第7天时cHSCs进入对数生长期且达到高峰,其中cHSCs+cBMSCs+细胞因子组细胞数量显著高于cHSCs+细胞因子组(P<0.05)。随着cHSCs传代培养,细胞分化潜能发生了变化,P1、P2、P3代细胞CD34分子阳性百分比、SOX 2基因mRNA表达水平均极显著低于P0代(P<0.01),P1、P2代OCT-4基因mRNA表达水平极显著高于P0代(P<0.01),P1代OCT-4基因mRNA表达水平极显著高于P2代(P<0.01)。【结论】本研究成功从犬骨髓中分离出cHSCs,筛选的cHSCs体外增殖最优培养条件为含10%FBS的IMDM培养基、cHSCs与cBMSCs接种比例为1∶10,同时联合添加TPO+FLT-3+SCF+IL-6细胞因子,P1代cHSCs处于对数生长期且CD34阳性百分比较高,可为今后临床应用提供参考。

犬造血干细胞移植的作用机制及应用研究进展

造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)位于造血系统的顶端,是造血系统中唯一具有多能性和自我更新能力的细胞,可以分化为各种功能的血细胞,维持血液系统的建立和动态平衡,是目前研究最为透彻、临床应用最为成熟的成体干细胞。造血干细胞的这些重要特性,使得基于造血干细胞在治病机制研究和临床应用中的研究取得了很大进展。以造血干细胞为基础的再生医学治疗是目前治疗恶性血液病和遗传病的首选方法,如造血干细胞治疗犬白细胞黏附缺陷综合征、犬遗传性贫血、犬淋巴瘤、犬白细胞减少症、犬X连锁严重联合免疫缺陷病等,但由于白细胞抗原匹配的供体稀缺、可获得的造血干细胞数量有限等原因,无法满足临床需求,因此,如何通过体外培养获得满足临床需要的造血干细胞成为近年来学者们研究的热点问题。作者参照现有研究成果对造血干细胞的来源和体外分离培养、治病机制进行系统的描述,并对造血干细胞移植治疗遗传性溶血性贫血、白细胞黏附缺陷综合征、淋巴瘤、白细胞减少症、X连锁严重联合免疫缺陷病的临床研究进行综述,以期为今后将造血干细胞广泛应用于临床治疗提供参考依据。

西咪替丁对低剂量辐射比格犬的保护作用

目的观察西咪替丁对低剂量电离辐射比格犬的保护作用。方法雄性比格犬24只,共6组,每组4只,分别为正常对照组,模型对照组,阳性药对照组,西咪替丁低、中、高剂量组(5.33、10.67、21.33mg·kg^(-1)),采用60 Coγ射线连续全身照射23d,剂量率为0.0408mGy·min^(-1)。西咪替丁于照射期间连续灌胃给药,每天1次。分别于累积照射剂量为0.2、0.4、0.6、0.8和1.0Gy时,检测外周血象,并在累积照射剂量为1.0Gy时检测CD34^+细胞、血清中抗氧化酶和丙二醛。结果累积照射期间,各组比格犬的血象检测值均在正常值范围内波动。与正常对照组比较,累积照射1.0Gy后24h,比格犬骨髓造血干细胞数量显著降低(P<0.01),血清中的SOD、CAT、GPx及GST活力显著降低(P<0.01,P<0.05),MDA含量显著升高(P<0.01)。与辐照模型组比较,西咪替丁中剂量组造血干细胞明显升高(P<0.05),各给药组的SOD和CAT活力均显著升高(P<0.01),西咪替丁高剂量组的GPx和GST活力显著升高(P<0.01,P<0.05),西咪替丁中、高剂量组的血清MDA含量显著减少(P<0.01)。结论西咪替丁可有效改善1.0Gyγ射线累积照射比格犬所致的造血干细胞数量减少和抗氧化系统损伤,具有较好的辐射保护作用。