犬骨髓间充质干细胞的生长特点和在诱骨条件下的成骨特性

为了研究犬骨髓间充质干细胞(can ine m esenchym a l stem ce lls,cM SC s)的生长特点和在诱导条件下的成骨特性。使用密度梯度法分离成年犬骨髓间充质干细胞进行培养,保留贴壁细胞传代,观察,以地塞米松、β甘油磷酸钠、抗坏血酸为成骨诱导剂。利用倒置光学显微镜和透射电镜观察细胞形态特征,四甲基偶氮盐(M TT)比色测定增殖,用碱性磷酸酶(A lka line phosphatase,ALP)活性及骨钙素(O steoca lc in,OCN)含量来研究细胞分化情况。形态学观察表明,cM SC s贴壁细胞呈集落生长,有成纤维细胞样外观,透射电镜可见成骨诱导后cM SC s具有分泌型细胞的特征;推测成骨诱导剂可促进骨髓间充质干细胞成骨,表现为ALP活性、OCN含量明显升高。本实验表明所培养的cM SC s保持了未分化状态,并在成骨诱导剂的作用下可向成骨细胞分化。

姜黄素对犬骨髓间充质干细胞迁移能力的影响

【目的】探讨姜黄活性成分姜黄素(curcumin,Cur)对犬骨髓间充质干细胞(canine bone marrow mesenchymal stem cells,cBMSCs)迁移功能的影响。【方法】取体外传代培养条件下cBMSC作为试验材料,分别设置P3-cBMSCs为P3组,P6-cBMSCs+Cur(0、0.1、1和10μmol/L)为姜黄素处理组。采用细胞划痕实验、Transwell细胞迁移实验、微丝绿色荧光探针(Actin-Tracker Green-488)染色、RT-qPCR、细胞坏死与凋亡检测和细胞相对端粒长度检测来评估姜黄素对cBMSCs迁移能力的影响。【结果】与P3组相比,P6-cBMSCs划痕愈合率和Transwell小室外表面细胞迁移数量随着传代次数增加而降低(P<0.01);且细胞圆合度较高,应力纤维弯曲且稀少;迁移相关因子MMP-2和MMP-9的基因表达水平显著下调(P<0.01)。经姜黄素处理后,P6-cBMSCs迁移能力提高,细胞应力纤维数量和排列均得到改善;迁移相关因子(MMP-2和CXCL8)的基因表达水平均显著上调(P<0.01);细胞凋亡和坏死延缓,细胞活力得到维持;细胞相对端粒长度缩短迟滞。【结论】Cur可以改善cBMSCs因体外扩增培养而受损的迁移能力,且以1μmol/L的浓度作用最佳。

骨碎补总黄酮对缺氧环境中犬骨髓间充质干细胞成骨分化潜能的影响

拟研究骨碎补总黄酮对缺氧环境中犬骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化潜能的影响。运用骨碎补总黄酮(TFDR)干预低氧浓度(10%)环境中犬BMSCs 4周后诱导成骨分化,倒置显微镜观察茜素红染色BMSCs钙结节形成,比色法检测碱性磷酸酶(ALP)活性水平,流式细胞术检测细胞线粒体膜电位,激光共聚焦显微镜和RT-PCR检测成骨分化关键基因Runx2、Osterix的表达。结果显示:与对照组相比,10%氧浓度抑制了犬BMSCs钙结节形成和ALP活性(P<0.01),线粒体膜电位降低(P<0.05),Runx2、Osterix表达降低(P<0.05或P<0.01);与低氧组相比,TFDR能显著促进低浓度氧中BMSCs钙结节产生和ALP活性(P<0.05),线粒体膜电位升高(P<0.05),促进Runx2、Osterix表达升高(P<0.05或P<0.01)。骨碎补总黄酮能够促进低氧浓度下犬BMSCs向成骨方向分化。

细胞自噬对犬骨髓间充质干细胞干性的影响

本研究旨在探讨细胞自噬对犬骨髓间充质干细胞(cBMSCs)干性的影响。分离培养cBMSCs,将其分为对照组、使用雷帕霉素促进细胞自噬的雷帕霉素组、使用3-MA抑制细胞自噬的3-MA组,于药物处理12、24、48 h后收集细胞,利用间接细胞免疫荧光法检测自噬微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC 3Ⅱ)的蛋白表达水平;荧光定量PCR检测自噬相关基因LC 3、Beclin 1、自噬相关基因7(Atg 7)以及干性相关基因性别决定基因相关转录因子2(Sox 2)、特异AT序列结合蛋白2(Satb 2)mRNA转录水平;通过茜素红染色检测经成骨诱导的cBMSCs的成骨分化能力,通过油红O染色检测经成脂诱导的cBMSCs的成脂分化能力。结果显示:雷帕霉素组的LC 3Ⅱ蛋白表达量上调,3-MA组则为下调。雷帕霉素组干性相关基因与自噬相关基因在不同时间点的表达水平均有不同程度的上调,且随感染时间的延长呈上调趋势;3-MA组干性相关基因与自噬相关基因的mRNA转录水平在不同时间点不同程度降低,且随感染时间延长呈下调趋势。成骨诱导试验中雷帕霉素组cBMSCs形态变化最明显,且矿化面积较大,3-MA组细胞矿化面积小;成脂诱导试验中雷帕霉素组脂滴数量少,3-MA组脂滴数量多且聚集程度高。在一定程度上促进cBMSCs自噬水平可以更好地维护其干性并提高成骨分化能力,为优化治疗中cBMSCs的质量提供理论基础和技术支持。

JNK信号通路对犬骨髓间充质干细胞多能性基因表达的影响

旨在探讨c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路对犬骨髓间充质干细胞(cBMSCs)多能性基因的影响。采用密度梯度分选法提取cBMSCs,培养至第3代应用流式细胞术鉴定细胞表面标记物后,将其分为对照组、添加JNK信号通路抑制剂SP 600125的抑制组培养。采用MTT法检测细胞活性,荧光定量PCR检测JNK信号通路相关基因Ras相关的C3肉瘤毒素底物1(RAC 1)、激活转录因子2(ATF 2)和多能性相关基因多梳蛋白4(CBX 4)、性别决定基因相关转录因子2(Sox 2)的mRNA转录水平。流式细胞术检测培养细胞的结果显示,CD34、CD11a、CD45为阴性,CD44和CD90为强阳性,符合间充质干细胞细胞表面标记物特点。与对照组相比,抑制组细胞存活率升高,JNK信号通路因子RAC 1、ATF 2 mRNA转录水平明显下降,多能性相关基因CBX 4、Sox2的mRNA表达水平明显升高。结果表明通过抑制JNK信号通路有助于cBMSCs多能性基因的表达从而维持cBMSCs的多能性。

同源异体骨髓间充质干细胞移植治疗犬急性肝功能损伤

探讨同源异体骨髓间充质干细胞(BMMSCs)移植对犬急性肝功能损伤的治疗作用,为犬干细胞治疗相关疾病提供理论基础和技术支持。对患急性肝损伤的10只病犬经超声引导腹腔内肝门附近移植BMMSCs,移植后检测血常规、肝功能和肝脏B超,观察同期的症状体征和不良反应情况。结果显示,干细胞移植7天后可使患犬各项肝功能指标明显改善,10d后B超结果显示肝组织回声均匀,无明显异常,14d后患犬的精神、体力、食欲明显好转,干细胞移植21d后血常规各项指标恢复正常,患犬基本康复,移植干细胞的患犬均未发现有不良反应。说明相对于常规治疗,犬BMMSCs同源异体移植治疗急性肝损伤可明显缩短治疗时间,显著提高患犬生活质量。

永生化犬骨髓间充质干细胞株的建立

为了建立永生化的犬骨髓间充质干细胞(cBMSCs)株,为其在基础研究方面的应用创造方便快捷的途径,本试验将构建好的pLOX-Ttag-iresTK慢病毒载体包装后感染cBMSCs,连续培养传至50代,通过细胞形态观察、细胞计数、RT-qPCR基因表达分析、Western blot、流式细胞术以及三系分化鉴定永生化cBMSCs。结果显示,永生化cBMSCs形态呈长梭状,生长曲线呈“S”型,且相对于野生型增殖较快,可成功表达SV40T;具有BMSCs特异性表面标志,并可诱导分化为成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞。因此,可以通过SV40来建立永生化细胞株,所得到的SV40-cBMSCs有较为良好的生长状态,其符合永生化细胞特征,为后续cBMSCs在试验研究方面的运用奠定基础。