狂犬病毒糖蛋白衍生物作为靶脑载体初探

血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)阻碍了具有治疗潜力的大分子化合物从外周组织进入脑内。为了寻找一种高效、快速通过BBB的靶向性载体,实验通过罗丹明B标记的狂犬病毒糖蛋白衍生肽(RDP)注射入昆明小鼠体内,并于15 min、5 h取大脑、脊髓及肝、肾等外周组织,冷冻切片观察其在体内的分布,并通过构建pET28a-RDP-luciferase重组质粒,结果发现融合蛋白能快速地穿过血脑屏障分布于中枢神经系统,为治疗中枢神经系统的药物开发提供新的思路。

狂犬病毒糖蛋白衍生肽作为耙脑载体研究

狂犬病毒糖蛋白（rabies virus glycoprotein，RVG）为一种嗜神经性的蛋白质，能够促使病毒向中枢神经系统移动。将狂犬病毒糖蛋白（rabies virus glycoprotein，RVG）的衍生肽段与荧光素酶（1uciferase）的基因在pET28a（＋）上构建新的载体，

表达狂犬病毒糖蛋白的重组痘苗病毒的组建与鉴定

把狂犬病毒标准攻击株(Standard challenge virus)的糖蛋白编码序列插入天坛株痘苗病毒的胸腺核苷激酶(TK)基因区,并置于痘苗病毒7.5k蛋白启动子(P7.5)的控制之下,构建了两株重组痘苗病毒。它们在起始密码子上游一侧的核苷酸序列稍有差别,但均能有效地表达狂犬病毒的成熟糖蛋白并能转运至细胞膜上。免疫学试验及动物试验结果表明,重组痘苗病毒表达的狂犬病毒非融合性糖蛋白分子量约为64kD;均能与狂犬病毒天然糖蛋白单克隆抗体发生特异性反应,并能在小鼠和家兔中诱生高滴度狂犬病毒中和抗体(VNA)并对致死量狂犬病毒攻击动物具有保护能力。

我国四株狂犬病毒糖蛋白基因序列分析和位点比较

测定我国人用狂犬疫苗株 (aG)、减毒株 (CTN 181)及两株街毒糖蛋白 (GP)基因cDNA的核苷酸序列及推导氨基酸序列。结果两株街毒仅相差两个碱基和一个氨基酸残基 ;两株街毒与CTN的同源性 (85.9% )高于aG株 (81.9% ) ;聚类分析将街毒和固定毒分为两支。比较GP嗜神经位点的氨基酸序列与蛇神经毒素同AChR结合部位高度同源。被认为决定毒力的 333位Arg ,CTN发生了Q替换 ,其它毒株均为Arg333。所比较的毒株均存在 319位糖基化位点 ,此外 37位糖基化位点也相对保守 ;GP两个主要抗原表位 ,GⅡ的氨基酸构成完全一致 ,GⅢ只在一些减毒株中发生与毒力密切相关碱基的替换。

伪狂犬病毒上海株糖蛋白G (gG)基因的克隆及序列分析

应用PCR方法从PRVSH (上海株 )病毒培养物扩增了gG基因 ,克隆入 pcDNA3质粒 ,并进行了序列测定。结果表明 ,扩增的 gG基因片段长 1719bp ,包含一个 14 91bp的开放阅读框 (ORF) ,在起始密码子上游有TATAAAA盒 ,在终止密码子下游有AATAAA的 poly (A)尾 ,编码由 4 96个氨基酸组成的蛋白质。与Rice株相应的gG片段相比 ,核苷酸序列同源性达 97 1%。但推导的氨基酸序列同源性仅有 87 6 % ,主要是在编码区内插入和缺失核苷酸 ,出现了突变和移码 ,导致氨基酸序列同源性降低。gG具有膜蛋白的结构特点。

狂犬病毒CVS-N2c毒株糖蛋白基因的克隆和重组腺病毒的构建

克隆了狂犬病毒CVS N2c毒株糖蛋白 (GP)基因 ,并进行了GP全基因序列测定和对比分析。结果显示CVS N2cGP基因编码区长 15 75bp ,编码 5 2 4个氨基酸 ,与国内外发表的狂犬病毒疫苗株 3aG株、ERA株、和HEP Flury株GP基因的核酸序列同源性分别为 89 0 % ,89 3% ,94 5 % ,而推导的氨基酸序列同源性分别为 87 6 %、88 4 %、和91 2 %。在此基础上 ,用pAdEasy载体系统构建了表达GP基因的重组腺病毒。电镜下确定重组病毒颗粒的直径约70nm ,Westernblot显示重组病毒表达的GP蛋白可被兔抗狂犬病毒血清识别 ,表达的GP蛋白分子量约为 6 6kD ,与天然的狂犬病毒GP的分子量相符。该表达CVS N2c毒株GP基因的重组腺病毒是筛选有效狂犬病毒基因工程疫苗的基础。

狂犬病毒aG株糖蛋白在CHO细胞中的表达

目的克隆狂犬病毒aG株糖蛋白(Glycoprotein)基因,构建重组真核表达载体,在CHO细胞中表达aG株糖蛋白。方法采用RTPCR,从狂犬病毒aG株基因组RNA中扩增GP基因,并将该基因克隆至真核表达载体pCIdhfr上,以脂质体介导法转染CHOdhfr-细胞。用MTX筛选的抗性克隆经ELISA、免疫荧光及Westernblot检测GP蛋白的表达。结果克隆到狂犬病毒aG株糖蛋白全长基因,并在CHO细胞中进行表达。结论成功地在CHO细胞中表达了狂犬病毒aG株的糖蛋白,为进一步开发狂犬病毒基因工程疫苗打下基础。

狂犬病毒aG株核蛋白和糖蛋白双表达质粒的构建及其在真核细胞中的表达

目的构建狂犬病毒aG株核蛋白(NP)和糖蛋白(GP)双表达重组质粒,在中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)中表达核蛋白和糖蛋白。方法提取狂犬病毒RNA,应用RT-PCR方法扩增NP和GP基因,分别将其克隆到pIRES载体上,获得同时含有NP和GP基因的双顺反子重组质粒pING,并以脂质体介导法转染CHO-K1细胞,G418筛选,用ELISA和IFA检测NP和GP的表达。结果限制性内切酶分析表明重组质粒pING含有NP和GP基因片段,长度分别为1353bp和1575bp。应用ELISA和IFA方法,在转染细胞中均检测到NP和GP的表达。结论重组双表达质粒可在CHO细胞中同时表达NP和GP,为进一步开发重组狂犬病疫苗奠定了基础。

狂犬病毒分离株糖蛋白基因的克隆与序列分析

为分析狂犬病毒(RV)分离株糖蛋白基因之间的差异,本研究采用RT-PCR的方法扩增由广东某地临床表现正常犬的唾液中分离的RV(GD33)分离株的G基因,将其克隆、测序后与国内外部分毒株相应基因进行核苷酸序列比较,结果表明,该分离株与其他毒株相比核苷酸同源性为94%～97.1%;氨基酸同源性为97%～99.2%。而GD33分离株与HEP-Flury株在跨膜区、膜内区有很高的一致性;另外,GD33分离株与HEP-Flury和FluryLEP株在333位点出现精氨酸被取代的现象,证实GD33分离株这2个疫苗株没有显著差异,对监控我国狂犬病疫情具有一定的意义。

狂犬病毒糖蛋白基因的重排及病毒的拯救

为了从分子水平研究狂犬病糖蛋白基因(G)从第4位重排至第1位后病毒的结构、功能及病毒致病性的变化,运用基因突变、反向遗传技术的原理与方法,将狂犬病毒(RV)糖蛋白基因从野生型的第4位(N-P-M-G-L)重排于第1位(G-N-P-M-L),并成功地拯救已发生基因重排的狂犬病毒.

狂犬病毒糖蛋白及其中和性抗体研究进展

狂犬病是一种由狂犬病毒引发的高致命人兽共患传染病,狂犬病毒糖蛋白作为唯一暴露于包膜外的病毒蛋白可有效诱生中和性抗体。本文介绍了狂犬病毒及其糖蛋白结构与功能,全面综述了狂犬病毒中和抗体研究进展及其作用机制,为中和抗体的深入研究提供理论基础和研发策略。

狂犬病毒糖蛋白重组的新城疫病毒诱导人胃癌SGC细胞自噬

目的:观察狂犬病毒糖蛋白重组的新城疫病毒(rabies virus glycoprotein recombinated Newcastle disease virus,r L-RVG)及野生型新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)对胃癌SGC细胞自噬的影响。方法:将SGC细胞随机分为3组,rl-RVG组(转染rl-RVG)、NDV组(转染NDV)、对照组(转染PBS),24 h后观察细胞的形态变化,评价病毒对细胞的影响。用免疫双标记和免疫印迹法鉴定病毒感染是否成功;蛋白质印迹检测各组细胞自噬相关蛋白LC3及Beclin1的表达;透射电镜观察细胞内超微结构的变化和自噬体的形成。结果:病毒感染细胞24 h后,rl-RVG组及NDV组细胞皱缩明显,且rl-RVG组较NDV组变化明显,对照组无明显变化;rl-RVG组和NDV组细胞LC3及Beclin1蛋白表达较对照组明显升高(P<0.05),且rl-RVG组明显高于NDV组(P<0.05);rl-RVG组及NDV组出现的自噬体明显多于对照组,且rl-RVG组较NDV组明显增多(P<0.05)。结论:r L-RVG较NDV更易引起胃癌SGC细胞的自噬。

狂犬病毒糖蛋白的克隆表达及其在中和抗体检测中的应用

目的:制备基因工程表达的狂犬病毒糖蛋白优势表位抗原,并评价其在疫苗免疫后中和抗体检测中的应用价值。方法:TRIzol法从狂犬病疫苗中提取总RNA,经RT-PCR获得糖蛋白目的基因片段,构建相应的原核表达质粒,转化大肠杆菌HB101,诱导表达获得纯化重组蛋白,以重组蛋白作为包被抗原,初步建立检测糖蛋白中和抗体的ELISA方法。结果:获得狂犬病毒糖蛋白优势表位区段抗原,建立了糖蛋白中和抗体ELISA检测方法。该检测方法对59例健康献血员血浆样本检测特异性为98.31%(58/59),接种狂犬疫苗免疫个体血浆样本抗体阳性率为98.95%(94/95)。结论:基因工程表达的狂犬病毒糖蛋白优势表位抗原可用于人接种狂犬疫苗后疫苗免疫效果评价。

狂犬病毒3aG株糖蛋白基因克隆及真核表达载体的构建

目的 构建含狂犬病毒 3a G株糖蛋白的重组质粒p CI- neorab G,为进一步表达及 DNA免疫做准备 .方法 从感染了狂犬病毒 3a G株的鼠脑组织中提取总 RNA进行 RT-PCR,扩增出编码糖蛋白的基因片段 ,重组入 p UC19克隆载体 .再将 p UC19rab G中的糖蛋白基因片段亚克隆入 p CI- neo真核表达载体 .结果 从 3a G株基因组中扩增出特异的糖蛋白基因片段 ,克隆成功 p UC19rab G;经亚克隆 ,筛选鉴定获得了 p CI- neorab G 重组质粒 .结论 构建成功狂犬病毒p U C19rab G重组质粒 ,亚克隆成功 p CI- neorab G重组质粒 ,为下一步表达及

用Lac基因筛选表达狂犬病毒糖蛋白的重组痘苗病毒

为了研制基因工程狂犬病疫苗,我国于1991年首次报道了在痘苗病毒天坛株中表达狂犬病毒糖蛋白,但报道中重组病毒的选择是先经人骨髓瘤细胞(TK-143)在诱变剂5-溴脱氧尿苷(BrudR)作用下通过标记拯救技术筛选出携带有同源基因的重组病毒,然后再利用重组病毒中携带的Lac基因为选择标记,通过噬斑纯化获得重组病毒,用这种选择方式获得的重组病毒,经过了TK-143细胞和BrudR,因此不宜发展成疫苗,本研究探索不经过TK-143细胞和BrudR,仅利用Lac基因为选择标记,直接在鸡胚细胞上通过噬斑纯化获得重组病毒,现将研究结果报道如下。

猪伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gB主要抗原表位区基因的克隆及原核表达

参照GenBank发表的猪伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gB主要抗原表位的编码区基因序列,设计一对引物,通过PCR扩增后,将约为600bp的目的片段克隆到pGEM-T载体上,酶切后插入原核表达载体pET-32(a)的T7启动子下游,构建的重组质粒pET-gB经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达。SDS-PAGE结果显示,表达产物分子量约为42.4KDa,主要以包涵体形式存在。BandScan分析表明,表达量约占菌体蛋白的60.5%。利用His亲和层析方法得到了纯化的表达产物。Western blotting结果显示,重组蛋白能与阳性血清发生特异性反应,具有较好的抗原反应原性,可以作为检测用抗原。

人源抗狂犬病毒糖蛋白稳定型抗体精氨酸密码子突变株的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

目的:对人源抗狂犬病毒糖蛋白(GPRV)单链二硫键稳定抗体(ScdsFv)进行精氨酸密码子修饰,实现其在酵母中的分泌表达,并检测其生物学活性。方法:参照巴斯德毕赤酵母偏好密码子,对抗GPRV ScdsFv原核表达基因进行密码子修饰,并通过点基因融合技术构建ScdsFv重组酵母表达基因,连接pPIC9K构建重组表达质粒pPIC9K-ScdsFv,电转化毕赤酵母GS115,经筛选后进行甲醇诱导表达。结果:SDS-PAGE及Western blot检测到重组表达质粒在30℃经甲醇诱导表达的蛋白相对分子质量为30000;荧光抗体试验验证ScdsFv能靶向结合GPRV;MTT试验说明ScdsFv能中和狂犬病毒,具有一定的细胞保护作用。结论:重组ScdsFv在酵母系统中可以有效表达,具有较好的生物学活性。

表达狂犬病毒糖蛋白的重组痘苗病毒的组建与鉴定

把狂犬病毒标准攻击株(CVS)的糖蛋白编码序列插入天坛株痘苗病毒的胸腺啶核苷激酶(TK)基因区,并置于痘苗病毒7.5K蛋白启动子(P7.5)的控制之下,构建了两株重组痘苗病毒,它们在起始密码子上游一侧的核苷酸序列稍有差别,但均能有效地表达狂犬病毒的成熟糖蛋白并能转运至细胞膜上,免疫学试验表达的狂犬病毒非融合性糖蛋白分子量约为64kD;均能与狂犬病毒天然糖蛋白单克隆抗体发生特异性反应,并能在小鼠和家兔中诱生高滴度狂犬病毒中和抗体(VNA),对致死量狂犬病毒的攻击具有动物保护能力。

狂犬病毒糖蛋白和核蛋白在不同表达系统中的表达

狂犬病波及范围广，所致疾病症状严重，病死率极高，无有效治疗手段，其控制主要依赖于疫苗的接种。狂犬病毒的糖蛋白和核蛋白是有效的保护性抗原成分，常被用来制备亚单位疫苗。糖蛋白和核蛋白在大肠杆菌、酵母、痘病毒、腺病毒、杆状病毒和中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）中均进行表达，大肠杆菌中表达出的蛋白无免疫保护作用，酵母、痘病毒、腺病毒和杆状病毒系统中表达出的蛋白在实验室和野外对动物均有一定的免疫保护作用。