假病毒中和试验对狂犬病毒中和抗体效价的检测效能分析

目的:组织不同的实验室分析假病毒中和法(Pseudo Virus-based Neutralization Assay,PBNA)对不同样品的狂犬病病毒中和抗体水平的检测能力,并比较其与经典的快速免疫荧光灶抑制试验(Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test,RFFIT)以及小鼠中和试验法(Mouse Neutralization Test,MNT)的相关性。方法:共9家实验室,分别采用PBNA、RFFIT以及MNT法对6份样品进行狂犬病病毒中和抗体检测,每个实验室进行3~5次重复实验。采用配对t检验及Pearson相关系数对3种检测方法的结果进行统计学分析。结果:PBNA与RFFIT、PBNA与MNT、RFFIT与MNT Pearson相关系数分别为0.985、0.988和0.974,抗体几何平均滴度进行t检验,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:3种方法重复检测6份样品的定量结果具有高度的相关性,PBNA法可作为《中华人民共和国药典》方法RFFIT、MNT的一种替代或补充方法,用于人用狂犬病疫苗临床血清、狂犬病人免疫球蛋白及抗狂犬病血清的狂犬病病毒中和抗体效价检测。

猪伪狂犬病毒抗体检测方法的研究进展

伪狂犬病,也称阿氏病(Aujeszky'sdisease),是由伪狂犬病毒(PRV)引起的一种高度传染性疾病。在没有特定宿主的情况下,伪狂犬病毒可以侵入多种哺乳动物,包括猪、牛、羊等,从而导致易感动物发生严重的临床症状和急性死亡。我国于20世纪50年代首次报道猪伪狂犬病,且自2011年以来,部分地区出现新的猪伪狂犬病变异株,致使养猪业遭受严重的经济损失。尽管科学家们一直在致力于诊断方法的设计和相关疫苗的开发,但伪狂犬病仍在养猪业广泛存在,近些年发现其对人类的健康也存在着潜在威胁,从而引起了世界范围内的强烈关注。目前我国的猪场普遍实行伪狂犬疫苗免疫,因此检测免疫后疫苗产生的抗体水平至关重要。本文总结目前对PRV的抗体检测方法,针对其优缺点进行对比分析,以对猪场临床上选择抗体检测方法提供参考。

三种ELISA方法与荧光抗体病毒中和试验检测狂犬病抗体的一致性分析

为筛选合适狂犬病抗体检测的试剂盒,该研究以荧光抗体病毒中和试验(fluorescent antibody virus neutralization FAVN)方法为参照,与3个ELISA试剂盒方法进行比对,进行一致性分析,并计算了三种试剂盒的敏感性和特异性。结果显示:三种不同的试剂盒中,试剂盒A与FAVN一致性最好,Kappa值为0.605,有较高的一致性,符合率为86%;试剂盒B次之,Kappa值为0.485,为中度一致,符合率为80%;试剂盒C与FAVN的一致性最差,Kappa值为0.310,符合率也最低,为74%。在敏感性和特异性方面,试剂盒A的敏感性最高,为92.1%,试剂盒B的特异性最高,为72.7%。本研究为临床上科学的筛选试剂盒提供了依据。

广东省部分城市犬和猫狂犬病病毒血清中和抗体的调查分析

通过对广东省部分城市宠物犬和猫狂犬病病毒中和抗体效价现状进行调查分析,探讨其风险点及改善点,为狂犬病的防控及公共卫生安全提供参考。调查于2020-2021年期间在广东省佛山市、深圳市、东莞市、云浮市、江门市等地城区采集宠物犬、猫血清735份,并对相关个体信息进行收集,采用荧光抗体病毒中和试验(FAVN)对所有血清样本进行了狂犬病中和抗体效价的测定和分析。结果显示,所有样本狂犬病抗体保护水平阳性率为46.9%,低于世界卫生组织推荐的70%保护水平阳性率;深圳市血清样本抗体保护水平阳性率为55.4%,为采样城市中保护水平阳性率最高;家养猫的保护水平阳性率比家养犬的阳性率低15.5%;犬养殖场样本阳性率比家庭饲养犬样本阳性率低20.8%;流浪动物的保护水平阳性率仅有8.1%。说明广东省部分城市犬、猫狂犬病免疫阳性率偏低,尚无法形成抵御狂犬病侵袭的有效屏障,需在流浪动物管理、猫饲养管理、犬猫饲养场管理等几个方面加强狂犬病的预防管制措施,加强政策引导工作,以提升狂犬病的综合防控能力。

狂犬病暴露后预防性单克隆抗体药物研究进展

简要介绍狂犬病的流行现状、发病机制、狂犬病病毒G蛋白中和抗原位点及其单克隆抗体的中和机制。重点介绍目前全球已上市或处于研发阶段的多种狂犬病病毒单克隆抗体药物的筛选发现技术、识别位点、作用方式以及体内外病毒中和效果,分析上述单克隆抗体在目前狂犬病暴露后治疗的应用推广中存在的问题,并针对当前狂犬病免疫球蛋白存在的血源供应、中和效价、质量控制及潜在病毒感染等问题,指出狂犬病病毒单克隆抗体研发的重要性,尤其是抗体的中和效价和中和广度,进而提出针对狂犬病病毒遗传谱系Ⅱ/Ⅲ的全人源单克隆抗体开发,以及针对G蛋白多个抗原位点的单克隆抗体鸡尾酒(mAb cocktail)疗法是当前在狂犬病暴露后预防性单克隆抗体药物研发中亟待解决的问题。

狂犬病病毒CTNCEC25株保护效果的研究

目的研究狂犬病病毒CTNCEC25株制备的疫苗对狂犬病街毒株BD06和8202株的保护效果。方法选取无狂犬病免疫史,中和抗体≤0.1 IU/mL的受试犬20只,随机均分为4组,供试疫苗(1、2组)和空白对照制品(3、4组)分别于0 d、7 d各免疫1次,每次免疫剂量为1支(1.0 mL)。14 d时采血测抗体,当天后肢肌肉注射攻毒。其中1、3组采用BD06株攻击,2、4组采用8202株攻击,攻毒后观察90 d,记录各组犬发病死亡情况。结果首免后14 d,供试疫苗免疫两组犬的平均中和抗体效价为(9.94±4.24)IU/mL。攻毒后90 d(首次免疫后104 d)时,供试疫苗两组犬的平均中和抗体效价为(3.41±4.07)IU/mL,所有受试犬血清狂犬病中和抗体水平均大于WHO规定的0.5 IU/mL。结论狂犬病病毒CTNCEC25株制备的疫苗对狂犬病病毒具有良好的交叉保护效果。

检测狂犬病病毒中和抗体的快速荧光灶抑制试验(RFFIT)方法的建立

在制备出抗狂犬病病毒（RV）核蛋白（NP）荧光标记抗体的基础上，建立起检测RV中和抗体的快速荧光灶抑制试验（RFFIT）方法。经与小鼠中和试验（MNT）比较，其重复性、特异性和灵敏度差异均无显著意义。该方法在大多数需要检测RV中和抗体的情况下可取代MNT。

RFFIT和MNT检测抗狂犬病毒中和抗体的比较研究

目的对RFFIT和MNT两种方法检测抗狂犬病毒中和抗体的相关性,敏感性和重复性进行比较。方法用MNT和RFFIT两种方法来检测已免疫的人血清52份,未免疫的人血清40份。结果显示这两种方法检测已免疫血清的一致性是88.5%,其相关性是r=0.886,MNT的敏感性和特异性分别是84.9%,100%;RFFIT的灵敏度和特异性分别是100%,89.0%。MNT和RFFIT重复检测一个样品的变异系数(CV)分别是62.3%、13.3%。结论RFFIT与MNT的相关性较好,RFFIT的灵敏度和重复性均比MNT好,因此,RFFIT在大多数需要检测RV中和抗体的情况下可替代MNT。

生猪伪狂犬病毒gB抗体与中和抗体的相关性分析

为探索生猪伪狂犬病毒gB–ELISA抗体水平的高低与中和抗体效价的相关性,运用酶联免疫吸附测定(ELISA)法对177份生猪血清进行了伪狂犬病毒gB抗体的检测,同时,用中和试验对上述血清样品进行了伪狂犬病毒中和抗体的测定。试验结果通过生物统计学分析,gE抗体阴性血清的g B抗体平均S/P值和中和抗体效价(SN效价)倒数平均值的相关系数为0.926,说明g B免疫抗体S/P值与其中和抗体效价有很好的相关性。中和抗体水平的高低一般与免疫保护力呈正相关,研究结果表明gB–ELISA抗体水平可以用来评估生猪对当前流行PRV毒株的相对免疫保护力。

猪伪狂犬病毒gB、gC和gD蛋白多抗制备及交叉中和抗体效价测定

为研究猪伪狂犬病毒（PRv）主要免疫原性基因的抗原变异情况，本研究构建了PRV变异株JS-2012和弱毒疫苗株Bartha—K61的gB、gc和gD基因重组真核表达质粒。通过基因枪途径免疫新西兰大白兔，对制备的兔源多克隆抗体进行交叉中和抗体效价的i／n,4定。结果显示，JS．2012和Bartha．K61株的gC蛋白和gD蛋白多抗对PRVJS．2012变异株、SC经典强毒株和Bartha．K61弱毒疫苗株的交叉中和效价均无显著差异；而两个病毒株的2B蛋白多抗对JS．2012和sc株的中和效价较低，分别为1：29．0～56．7和1：56．2～137．0，对Bartha—K61株以及其他毒力基因缺失弱毒疫苗株的中和效价较高，分别为1：75．0--490．0和1：198．6～986．9，差异显著，推测该结果可能与PRV毒力基因缺失有关。本研究为进一步鉴定PRV流行株的抗原变异奠定基础。

检测犬源狂犬病毒中和抗体ELISA方法的建立

为了有效监测犬免疫狂犬病疫苗后的保护效力,以狂犬病毒(Rabies virus,RV)糖蛋白的主要优势抗原表位区G3蛋白(RV G3)作为包被抗原,建立了一种检测狂犬病毒中和抗体效价的间接ELISA方法.通过优化反应条件,确定抗原最佳包被量为8 mg/L,血清的最佳稀释度为1∶100,酶标二抗的稀释度为1∶3 000.特异性试验表明,该抗原不与犬瘟热病毒、犬腺病毒、犬细小病毒阳性血清发生交叉反应;批内和批间重复性试验的平均变异系数都小于10%;敏感性达1∶1 280.此方法检测134份血清样品的结果与美国SYNBIOTICS试剂盒相比,总符合率达95.6%.

全人源抗狂犬病病毒G蛋白单链抗体制备及中和活性鉴定

目的:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,筛选针对狂犬病病毒G蛋白不同表位的单链抗体(scFv)并鉴定其中和活性。方法:分离130例经狂犬病疫苗免疫接种志愿者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,逆转录制备cDNA,构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库。以纯化的狂犬病病毒G蛋白包板筛选,对阳性克隆进行可溶性表达,并鉴定中和活性。结果:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,库容为5.0×107,经核酸序列分析,证实插入片段为scFv。经过5轮筛选,从富集的次级抗体库中随机挑出140个克隆,通过phage-ELISA鉴定得到4株核酸序列不同的scFv抗体。经His-Trap纯化后进行中和活性鉴定,获得1株有中和活性的scFv,其中和效价为0.13 IU/mg。结论:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,获得1株具有中和活性的抗狂犬病病毒G蛋白scFv抗体,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础。

狂犬病病毒糖蛋白膜外区表达及中和抗体间接ELISA检测方法的建立

采用RT-PCR方法克隆了狂犬病病毒CVS株G蛋白基因编码区,进而将完整编码区和膜外区编码基因分别克隆于pET-32a,将其中含膜外区编码基因的重组质粒pET-32a-PG转化BL21(DE3),经1.0 mmol.L-1IPTG诱导,外源基因获得高效表达。通过Western-blot以及ELISA试验证明表达产物具有良好的反应原性。以纯化后的表达产物作为抗原包被酶标板,用已知中和抗体效价的OIE参考血清对该方法进行了标准化,建立了检测狂犬病病毒中和抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原的最佳包被量为3.74μg,血清的最佳稀释度为1:100,待检血清阳性临界值为0.50。用此方法检测了418份血清样品,并与荧光抗体病毒中和试验(FAVN)方法进行了比较,符合率为98.61%。

人源抗狂犬病毒G蛋白单链抗体的生物学鉴定及其小鼠体内中和活性测定

目的对从噬菌体抗体库中筛选的人源抗狂犬病毒单链抗体A12进行生物学活性鉴定及小鼠体内中和活性检测。方法用免疫荧光法检测其结合感染狂犬病毒CVS的鼠脑组织的能力,用小鼠中和实验测定A12表达产物的体内中和活性。结果免疫荧光试验显示A12表达产物与感染CVS的鼠脑细胞有强的荧光反应。小鼠中和试验结果表明,A12ScFv样品组小鼠有9只存活,而对照组小鼠全部死亡。A12在729倍稀释时能100%保护小鼠抵抗致死量狂犬病毒的脑内攻击。结论A12对狂犬病毒具有一定的中和活性,有可能被用于暴露后狂犬病的预防。

狂犬病病毒中和抗体检测试剂盒的效果评价

目的应用快速荧光灶抑制试验(RFFIT)对狂犬病病毒中和抗体检测试剂盒的检测效果进行评价。方法用RFFIT和狂犬病病毒中和抗体检测试剂盒分别对135份人血清和164份动物血清进行狂犬病病毒中和抗体(RVNA)效价检测,应用SPSS22.0分析两种检测方法所得结果的相关性和一致性。结果两种方法所得结果的阳性检出符合率为99.33%(297/299);两种方法对动物血清和人血清的检测结果之间有较好的直线相关关系,相关系数分别为0.897和0.941;同一份标本的重复性检验显示,试剂盒检测方法具有较好的稳定性。结论狂犬病病毒中和抗体检测试剂盒可以用于人和动物血清狂犬病病毒中和抗体的检测。

狂犬病毒糖蛋白及其中和性抗体研究进展

狂犬病是一种由狂犬病毒引发的高致命人兽共患传染病,狂犬病毒糖蛋白作为唯一暴露于包膜外的病毒蛋白可有效诱生中和性抗体。本文介绍了狂犬病毒及其糖蛋白结构与功能,全面综述了狂犬病毒中和抗体研究进展及其作用机制,为中和抗体的深入研究提供理论基础和研发策略。

狂犬病毒糖蛋白的克隆表达及其在中和抗体检测中的应用

目的:制备基因工程表达的狂犬病毒糖蛋白优势表位抗原,并评价其在疫苗免疫后中和抗体检测中的应用价值。方法:TRIzol法从狂犬病疫苗中提取总RNA,经RT-PCR获得糖蛋白目的基因片段,构建相应的原核表达质粒,转化大肠杆菌HB101,诱导表达获得纯化重组蛋白,以重组蛋白作为包被抗原,初步建立检测糖蛋白中和抗体的ELISA方法。结果:获得狂犬病毒糖蛋白优势表位区段抗原,建立了糖蛋白中和抗体ELISA检测方法。该检测方法对59例健康献血员血浆样本检测特异性为98.31%(58/59),接种狂犬疫苗免疫个体血浆样本抗体阳性率为98.95%(94/95)。结论:基因工程表达的狂犬病毒糖蛋白优势表位抗原可用于人接种狂犬疫苗后疫苗免疫效果评价。

N-糖链切除对重组抗狂犬病毒单克隆抗体中和活性的影响

重组抗狂犬病毒单克隆抗体是一种全人源的抗病毒感染单抗,主要用于狂犬病毒暴露后预防。采用糖苷酶处理2种重组抗狂犬病毒单克隆抗体Mab1、Mab2水解切除N-糖链,通过糖染色和毛细管电泳检测确定N-糖链酶解程度,利用快速荧光灶抑制试验检测其中和活性,分析N-糖链切除对该单抗中和活性的影响。结果显示,N-糖链切除后抗体中和活性无明显变化。说明N-糖链对这两株抗狂犬病毒单抗的体外中和活性不是必须的结构成分。

单克隆抗体竞争ELISA和FAVN检测狂犬病病毒免疫抗体的对比

为对比狂犬病荧光抗体病毒中和试验(FAVN)和单克隆抗体竞争酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法的相关性,用2种血清抗体检测方法分别检测在深圳市收集的798份宠物犬血清样品,利用McNemar检验和Kappa一致性检验对比研究2种方法的检测结果。结果显示:以FAVN方法检测结果为标准,单克隆抗体竞争ELISA方法的符合率为96.7%(95%CI:95.3%~97.8%),敏感性为97.6%(95%CI:96.2%~98.5%),特异性为84.9%(95%CI:72.9%~92.7%),约登指数为0.825。经McNemar检验,2种血清抗体检测方法的检测结果差异不具有统计学意义(P=0.078>0.05);经Kappa一致性检验,2种血清抗体检测方法检测结果不一致是小概率事件(P<0.001),且两者的检测结果一致性高(Kappa系数=0.758)。结果表明,用单克隆抗体竞争ELISA方法代替FAVN用于犬狂犬病病毒免疫抗体的大规模监测具有一定的可行性。

狂犬病毒中和抗体检测试验中病毒回归试验的重要性

狂犬病毒中和试验的病毒回归试验表明,病毒攻毒液的实际剂量与理论剂量不完全一致。建议在新版《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》中增加对病毒攻毒实际剂量范围的规定,以使结果的判定更为合理。