伪狂犬病病毒荧光标签毒株构建及其在抗病毒药物筛选中的初步应用

为筛选针对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)的有效抗病毒药物,本研究以PRV人源分离毒株hSD-1/2019和经典猪源流行毒株Ea为亲本病毒,采用同源重组技术将mCherry报告基因插入到PRV的UL 35基因终止子之前位点,构建了表达红色荧光蛋白mCherry的荧光标签毒株PRV-mCherry。基于构建的荧光标签病毒,以荧光强度为指标,建立高通量药物筛选平台,对天然产物库中1621种化合物进行抗病毒药物筛选,并初步探索药物特性。结果表明,mCherry标签插入位置正确且稳定遗传,荧光标签毒株PRV-mCherry与亲本毒株在PK-15细胞上的增殖曲线趋势一致,且荧光强度可反映病毒增殖情况。使用PRV-mCherry从天然产物库中成功筛选出3种可在体外有效抑制PRV增殖的药物,根据测定的50%细胞毒性浓度和50%抑制浓度,计算出3种药物的选择指数范围为203.63~564.58μmol·L^(-1),表明其具有良好的成药性。本研究为临床防治PRV感染的抗病毒药物发掘提供了新的策略和思路。

狂犬病病毒CVS株G基因和IFN-α基因的克隆及双基因真核表达载体的构建

从狂犬病病毒CVS毒株致死的小鼠脑组织中提取总RNA,通过RT-PCR获得G基因;以pMD18-T-α质粒为模板,PCR扩增得到IFN-α基因。两个基因和pIRES真核表达载体分别双酶切,连接构建p IRES-G/IFN-α,经PCR、双酶切鉴定和测序证明载体构建成功。测得的G基因序列长1 575 bp,与CVS株G基因氨基酸同源性为98.5%;IFN-α序列长为570 bp,与GenBank中登录号为NM 001017411的IFN-α基因氨基酸同源性为91.6%。

狂犬病毒CVS-N2c毒株糖蛋白基因的克隆和重组腺病毒的构建

克隆了狂犬病毒CVS N2c毒株糖蛋白 (GP)基因 ,并进行了GP全基因序列测定和对比分析。结果显示CVS N2cGP基因编码区长 15 75bp ,编码 5 2 4个氨基酸 ,与国内外发表的狂犬病毒疫苗株 3aG株、ERA株、和HEP Flury株GP基因的核酸序列同源性分别为 89 0 % ,89 3% ,94 5 % ,而推导的氨基酸序列同源性分别为 87 6 %、88 4 %、和91 2 %。在此基础上 ,用pAdEasy载体系统构建了表达GP基因的重组腺病毒。电镜下确定重组病毒颗粒的直径约70nm ,Westernblot显示重组病毒表达的GP蛋白可被兔抗狂犬病毒血清识别 ,表达的GP蛋白分子量约为 6 6kD ,与天然的狂犬病毒GP的分子量相符。该表达CVS N2c毒株GP基因的重组腺病毒是筛选有效狂犬病毒基因工程疫苗的基础。

应用荧光定量PCR方法检测伪狂犬病病毒弱毒株在猪体组织中的分布

为了解伪狂犬病病毒(PRV)TK/PK/gE三基因缺失弱毒株在猪体组织中的分布情况,针对PRV gB基因保守区设计并合成1对特异性引物,建立并优化了一种可快速、定量检测PRV的SYBR-GreenⅠ荧光定量PCR方法。该检测方法特异性强且敏感度高,最低检测浓度为10^(1)拷贝/μL。PRV TK/PK/gE三基因缺失弱毒株免疫仔猪后可少量存在于大脑、小脑、肝脏、脾脏、肺脏、扁桃体和颌下淋巴结中,部分仔猪鼻甲骨病毒含量较高。应用本研究建立的荧光定量PCR方法阳性检出率为79.2%,而常规PCR方法阳性检出率仅为45.8%。结果表明,本研究建立的荧光定量PCR方法为了解弱毒株在猪体的分布提供了快速、敏感的检测手段。PRV TK/PK/gE三基因缺失弱毒株在猪组织中的分布情况为进一步揭示其组织嗜性、安全性和免疫机制提供了数据。

猪伪狂犬病病毒经典毒株与变异毒株双重实时荧光定量PCR方法的建立及应用

为了建立一种快速检测猪伪狂犬病病毒(PRV)经典毒株和变异毒株的双重实时荧光定量PCR方法,试验根据GenBank上收录的30株PRV设计gE基因和gC基因的特异性引物和探针,构建含有gE基因和gC基因的标准质粒,优化扩增体系建立双重实时荧光定量PCR方法,并检验该方法的特异性、敏感性和重复性,同时绘制标准曲线,最后采用该方法对临床样品进行检测。结果表明:试验建立的双重实时荧光定量PCR方法的最佳退火温度是60℃,最佳引物体积为0.8μL,最佳探针体积为0.4μL。该方法对猪场常见疫病病原猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪圆环病毒3型(PCV-3)、猪细小病毒(PPV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均无交叉反应,特异性强;对两种标准质粒pUC57-gE和pUC57-gC的最低检测限均为1×10^(1)copies/μL,gE基因和gC基因对应的标准曲线分别为y=-3.446x+41.920(R^(2)=0.998)和y=-3.255x+39.185(R^(2)=0.998);组内和组间变异系数均小于2%。临床样品检测结果的阳性率为10.53%,与《伪狂犬病诊断方法》(GB/T 18641—2018)的检测结果相同;变异毒株的阳性率为100%,扩增gC基因后的测序结果与GenBank中收录的PRV变异毒株一致。说明试验成功建立了可同时快速、准确鉴定PRV经典毒株和变异毒株的双重实时荧光定量PCR方法。

狂犬病病毒CVS-11株的培养及其效价测定

本研究通过神经瘤细胞（NA）培养CVS-11株狂犬病病毒,并测定不同批次的病毒毒价,为优化狂犬病疫苗的生产工艺提供数据支持,具有实际意义。病毒培养和检测结果表明,第1次和第2次收获的病毒液病毒含量较高,在107.0FFU/0.1 mL以上,毒力为106.4～107.0LD50/0.03 mL;而第3次收获的病毒含量则较低,只有106.0FFU/0.1 mL左右,毒力为105.0～105.3LD50/0.03 mL。第1次和第2次收获的病毒液可用于制备狂犬疫苗,第3次收获的病毒液因毒价较低不适于制备狂犬疫苗。

C株猪伪狂犬病疫苗免疫效果评价

越来越多的文献证实,国内流行的猪伪狂犬病毒株已经发生变异,其毒力、致病特点已经有了明显不同,因此很多人开始质疑经典毒株对新流行毒株的保护力。目前,国内很多疫苗厂家已经将猪伪狂犬病疫苗毒株更换为新的变异毒株,将其缺失致弱后用作疫苗株,比较知名的如HB-2000株、C株等。猪伪狂犬病病毒C株的不同之处在于其是自然致弱的毒株,病毒培养效果更好,容易收获更高的毒价,但其确切的效果还需要逐步验证。

中国19个狂犬病病毒街毒分离株N基因的序列分析

测定了 30年来从不同动物中分离的 19个中国狂犬病病毒街毒株N基因的部分核酸序列 ,并对其核苷酸差异做了比较分析。可将中国狂犬病病毒街毒株分为 4个组群 ,各组间的同源性为 83 45 %～ 88 6 2 %。除广西地区分离的狂犬病病毒街毒株彼此差异较大外 ,其余街毒株的地理分布与其N基因核酸序列差异的距离是密切相关的 ,基本上可按其地理分布分为东。

伪狂犬病病毒鄂A株TK^-/gG^-/LacZ^+突变株的构建

为了以国内地方分离株鄂A株为亲本构建伪狂犬病病毒双基因缺失株 ,采用外切酶Ⅲ和绿豆核酸酶酶切 ,构建了缺失主要毒力基因TK基因部分编码区的重组质粒 pSTK1-4 ,进一步改造成为转移质粒 pUCPB4。用HindⅢ将质粒pUCPB4线性化 ,然后与用EcoRI消化的伪狂犬病病毒鄂A株TK-/LacZ+ 突变株基因组DNA共转染PK- 15细胞 ,待完全病变后 ,收毒作空斑试验 ,PCR筛选TK缺失的重组病毒。重组病毒空斑纯化 3次 ,随机挑取空斑进行PCR扩增 ,证实所获得的病毒为均一的无TK-/LacZ+ 突变株污染的TK缺失的重组病毒。分别以TK缺失株病毒与鄂A野毒株为模板对TK基因进行PCR扩增 ,扩增产物经酶切分析和测序后发现 :TK缺失重组病毒的TK基因缺失了 2 0 5个碱基 ,XhoI和SalI位点消失 ,SmaI酶切片段发生变化。两种病毒在PK - 15细胞上形成空斑的大小和增殖的滴度无明显的差别。进一步提取TK缺失突变株基因组DNA ,与含gG -LacZ的转移质粒pUSKZ通过磷酸钙法共转染PK - 15细胞 ,待完全病变后 ,在X - gal存在下筛选蓝斑 ,将挑取的蓝斑纯化 3次后 ,对纯化的重组病毒进行TK、LacZ扩增 ,结果既能扩增出较以鄂A野毒株为模板扩增的要小的TK基因片段 ,同时又能扩增出LacZ基因 ,证实所得到的重组病毒为TK-/ gG-/LacZ+ 突变株。此双缺失突变株的构?

我国流行的4株狂犬病街毒株G基因序列及分子流行病学研究

目的探讨我国流行的狂犬病毒(RV)基因差异,评价现有疫苗的适用性。方法通过RT-PCR并对其产物测序后获得4株RV街毒株的G基因序列以及G与M和L基因的区间序列。利用计算机分析软件比较4株RV与已经发表的毒株的核苷酸和推导的氨基酸序列。结果糖蛋白(GP)完整的编码基因序列长度为1575 bp。GP氨基酸序列同源性明显高于相应的核苷酸序列(除Mokola外),4株街毒与CTN的同源性高于aG株。GP不同区段比较显示,膜外区同源性高于膜内区。G-M区间核苷酸序列长度为5 bp;除广西4外,其余毒株100％同源。GL区间核苷酸序列长度为2,4 bp,越1与肥东同源性为100％。结论4株RV均属于基因I型。广西的毒株之间存在不同的来源。街毒与疫苗株之间基因存在差异。4株RV与SAD-B19进化途径相近,与PV株相差较远。越1与肥东株亲缘关系极近,可能是由同一毒株演化而来。

广西12株狂犬病野毒株的g基因序列测定与分析

对广西12株狂犬病病毒株g基因全序列进行测序分析,结果显示:广西毒株属于I型,可分为3个群,即Ⅰ群、Ⅱ群和Ⅲ群。GX01、GX08、GX09、GX014、GX091、GX195、GX260、GXLA8株为Ⅰ群,GX219、GX074、GXBM3株为Ⅱ群,GXN119株为Ⅲ群。Ⅰ群的广西毒株g基因核苷酸的同源性为97.6%～99.9%,氨基酸同源性在97.7%～100%之间;Ⅱ群的核苷酸的同源性为98.2%～99.0%,氨基酸的同源性在98.5%～99.2%之间。糖蛋白在主要的抗原位点GI、GⅡ区以及与中和抗原有关的36、263、367位氨基酸没有变异,GⅢ区上只有Ⅱ群在332位缬氨酸变异为异亮氨酸,G蛋白上的氨基酸主要在-2、-5、-13、-14、-15、-16、90、96、132、140、156、168、170、204、241、249、253、264、289、332、382、427、436、445、463、474位共26个氨基酸发生了变异,这些氨基酸的变异具有群的特异性。

致病性猪伪狂犬病病毒PRV-JF株的分离与鉴定

从临床疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑组织病料中,经聚合酶链式反应(PCR)证实为猪伪狂犬病病毒(PRV)野毒感染,采用无PCV1污染的猪肾细胞系(PK-15)分离培养,经蚀斑克隆纯化,培育1株细胞培养适应毒,命名为PRV-JF株。该分离株经细胞培养传代,能够产生典型的细胞病变,病毒滴度随代次显著增加,第24代毒价达108.5 TCID50/mL。免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)检测病毒抗原分布在细胞核及细胞质内。病毒感染细胞可被已知PRV阳性血清中和。电镜负染观察到病毒粒子呈椭圆或圆形外观,无囊膜的病毒粒子直径约110 nm～150 nm,有囊膜的成熟病毒粒子直径约150 nm～180 nm。PCR鉴定该毒株含有gE基因,其序列与GenBank登录的7株PRV同源性为97.7%～100%。用不同剂量病毒培养物接种家兔于24 h～72 h内全部死亡。研究表明,PRV-JF分离株对易感动物具有高致病性,为进一步开展该病毒流行病学、致病机理、疫苗免疫与诊断研究奠定了基础。

猪伪狂犬病毒野毒株SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR诊断试剂盒的研制

根据GenBank中猪伪狂犬病毒(PRV)gE基因序列设计特异性的引物,PCR扩增获得PRV gE基因片段,构建重组质粒pMD18-T-gE,作为阳性标准品。对SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应条件进行优化,建立猪PRV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR诊断方法,研制诊断试剂盒。扩增产物的熔解曲线分析结果显示只出现单特异峰,无引物二聚体,对猪圆环病毒(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)、PRV(gE基因缺失株)、猪源E.coli、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)均无阳性信号扩增,且重复性好,灵敏度可达2.3×101拷贝/μL。结果表明,研制的PRV野毒株SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR试剂盒特异、灵敏、快速、重复性好,适于伪狂犬病毒临床样品的检测。

猪源伪狂犬病病毒传代致弱LA2017株的安全性和免疫效力研究

为检测猪源伪狂犬病病毒变异株AH02LA株作为疫苗后选株的安全性及免疫效力。本研究对4日龄初生仔猪和产前1个月妊娠母猪免疫LA2017株后的安全性、28~35日龄仔猪免疫效力以及免疫猪后排毒和同群传播性进行了研究。结果显示:滴鼻接种4日龄仔猪和肌肉注射产前1个月的妊娠母猪,均无任何临床症状,表明该疫苗株具有良好的安全性;肌肉注射接种28~35日龄的仔猪,免疫后7 d产生对PRV变异株AH02LA的完全保护并且可以阻止排毒,免疫14 d后攻毒均未发病和排毒,而PRV Bartha K61株免疫猪后7 d攻毒,有4头猪出现了体温升高,鼻拭子样品均检出病毒,免疫后14 d和21 d时对试验猪攻毒,PRV Bartha K61株免疫组均有猪发病,且鼻拭子样品均检出病毒;在抗体产生水平方面,PRV LA2017株免疫后14 d产生高水平中和抗体,PRV中和指数抗体≥10 000,且维持至免疫后5个月,而Batha-K61组免疫后1个月至3个月针对PRV变异株AH02LA的中和指数仅为178~1000,且4个月就开始下降;在同群感染方面,PRV LA2017株肌肉注射接种28~35日龄仔猪后14 d内均未从鼻拭子和肛门拭子检出排毒,gB抗体全部转为阳性,同群非免疫接种猪PRV gB和gE的ELISA抗体均为阴性,表明PRV LA2017株安全性好,无横向传播,不引起同群感染。结果表明,PRV LA2017株作为疫苗株对猪伪狂犬变异株的保护效果显著优于Bartha K61株,该毒株安全性好、抗体水平高和持续时间长,是一株极具开发价值的猪伪狂犬病流行株的弱毒疫苗候选株。

CTN株疫苗对中国狂犬病病毒街毒代表株的保护性

目的研究人用狂犬病病毒CTN株疫苗对中国狂犬病病毒街毒代表株的保护性,为评估该疫苗的适用性提供依据。方法用CTN株疫苗免疫昆明小鼠,用3株具有代表性的街毒株CQ92、HN06、J和标准攻击毒株CVS经脑内和肌肉攻击,以未免疫小鼠进行脑内和肌肉攻击为对照,观察CTN株疫苗的保护效果。结果原倍和5倍稀释的疫苗免疫的小鼠经3株街毒肌肉攻击后,均得到100%的保护,与对照组比较,差异均有极显著意义;经3株街毒脑内攻击后,原倍疫苗免疫的小鼠均得到100%的保护,5倍稀释的疫苗免疫的小鼠对3株街毒CQ92、HN06、J的保护率分别为85%、75%和77.8%,与对照组比较,差异均有极显著意义。结论CTN株疫苗总体上能有效预防我国目前狂犬病的流行。

福建省狂犬病毒街毒株分离鉴定及生物学特性研究

目的分离福建省狂犬病毒街毒株,了解病毒株的生物学特性。方法采集疑似狂犬的脑组织,通过细胞培养和乳鼠脑接种分离狂犬病毒,用直接免疫荧光和RT-PCR等方法进行鉴定,并对病毒的分子生物学特性进行研究。结果从疑似狂犬的脑组织中分离出狂犬病毒,TCID50的测定结果显示,细胞毒滴度不高,病毒株对BHK-21细胞的适应性不强,LD50的测定结果显示,病毒株为狂犬病毒强毒株。结论从福建省家犬中成功分离到狂犬病毒街毒株,为狂犬病的实验室研究奠定基础。

云南省楚雄地区猪伪狂犬病病毒野毒株的血清学调查

为了调查云南楚雄地区猪伪狂犬病病毒(PRV)野毒株感染的阳性率,从楚雄地区3个规模化养殖场以及18个散养户随机采集360份血清,采用间接ELISA方法对血清样本进行PRVgE抗体的检测。结果表明:360份猪血清中抗PRV抗体阳性率为35.00%。规模化猪场的196份样品中,阳性47份,阳性率为23.98%;散养户共164份样品,阳性79份,阳性率为48.17%。说明楚雄地区散养户饲养猪只PRV阳性率较规模化猪场高。

伪狂犬病病毒冀A株TK基因的克隆及序列分析

为了分析比较伪狂犬病病毒(PRV)冀A株TK基因与GenBank中收录的国内外其他PRV毒株TK基因核苷酸及氨基酸序列的同源性,以伪狂犬病病毒冀A株的基因组为模板,PCR扩增了其胸腺激酶(TK)基因,并对其进行了克隆和测序。结果表明,TK基因的开放阅读框(ORF)和所比较的各株的核苷酸和氨基酸同源性都在99%以上。核苷酸序列中发现在起始密码子的上游有3段GC框样的序列,在终止密码子中发现多聚腺苷加尾信号AATAAA;在氨基酸序列中发现有疱疹病毒TK基因的保守序列R*Y*DG**G*GK*T-和-FDRHP*A***C*P*AR-。

伪狂犬病毒粤A毒株TK基因的扩增、克隆与序列测定

以华南农业大学兽医学院传染病教研室分离的伪狂犬病毒粤A毒株 (PRVYA)的基因组为模板 ,利用聚合酶链反应 (PCR)扩增TK基因 ,获得预定大小的片段 ,将这一片段克隆到PMD18-T载体中 .对重组质粒PMD18-TK进行PCR鉴定、限制性内切酶分析和克隆片段的序列测定、比较 ,证实了克隆片段的可靠性 .

猪伪狂犬病病毒流行毒株gE/gI缺失突变株的构建及生物学特性研究

【目的】为研制针对猪伪狂犬病病毒流行毒株的疫苗提供候选毒株。【方法】构建针对猪伪狂犬病病毒流行毒株的gE/gI缺失重组转移质粒pMD-LA-RA及携带EGFP标记基因的重组转移质粒pMD-LA-EGFP-RA,将pMDLA-EGFP-RA与伪狂犬病病毒流行毒株PRV AH进行同源重组,利用EGFP为筛选标记,获得携带EGFP基因的gE/gI基因缺失突变株PRV AH gE~–/gI~–/EGFP^+,以此毒株与pMD-LA-RA进行第2次同源重组,筛选去除EGFP基因的gE/gI基因缺失突变株PRV AH gE~–/gI~–,并通过生长曲线、易感细胞连续传代和动物免疫评价其增殖能力、遗传稳定性及免疫原性。【结果】通过2次同源重组,结合荧光观察、空斑纯化和PCR检测,成功获得了PRV AH gE~–/gI~–,经PCR鉴定、荧光观察及测序鉴定,证实该毒株g E和g I基因被成功缺失,且不携带EGFP标记基因。生物学特性研究结果表明,该毒株增殖能力与亲本毒株相当,遗传稳定性及免疫原性良好。【结论】采用同源重组技术成功构建了免疫原性良好的猪伪狂犬病病毒流行毒株gE/gI基因缺失突变株,为研制针对流行毒株的基因缺失疫苗奠定了一定的基础。