基于MDCKⅡ细胞的中药成分体外肾毒性评价

目的用狗肾近端小管上皮（MDCKⅡ）细胞系研究中药成分的肾毒性，探讨其作为评价中药成分肾毒性体内动物实验替代方法的可能性。方法以氯化汞（HgCl2）为阳性对照，研究已知有肾毒性的马兜铃酸Ⅰ（AAⅠ）和马兜铃酸Ⅱ（AAⅡ），以及未见肾毒性报道的苦参碱、氧化苦参碱和肉豆蔻醚对MDCKⅡ细胞的毒性作用。用MTT法检测细胞存活；倒置显微镜观察细胞形态改变；乳酸脱氢酶（LDH）释放实验检测细胞膜损伤；流式细胞术分析细胞周期及细胞凋亡，用Hoechst33258染色法观察凋亡细胞形态变化。结果AAⅠ和AAⅡ分别与MDCKⅡ细胞作用24，48和72h细胞存活均被明显抑制，AAⅠ的IC50值分别为（63．4±6．6），（44．8±6．0）和（37．3±4．6）μmol·L^-1，AAⅡ的IC50值分另4为（125．7±6．2），（106．7±20．4）和（94．2±9．7）μmol·L^-1；在5—300μmol·L^-1时AAⅠ和AAⅡ分别与MDCKⅡ 细胞作用24h，LDH的释放率明显增高；AAⅠ（75μmol·L^-1）和AAⅡ（150μmol·L^-1）分别与MDCKⅡ细胞作用24h，倒置显微镜下可见细胞收缩变圆，部分细胞破裂脱落；用流式细胞仪和Ho-echst33258染色法观察亦发现，AAⅠ和AAⅡ均可使细胞周期S期阻滞，诱导MDCKⅡ细胞发生凋亡。苦参碱、氧化苦参碱和肉豆蔻醚在2～10mmol·L^-1浓度范围内分别与MDCKⅡ细胞作用24h，对上述指标均无明显影响。结论 MDCKⅡ细胞系对有肾毒性的AAⅠ和AAⅡ和未见肾毒性报道的苦参碱、氧化苦参碱和肉豆蔻醚的反应不同，可用于中药成分体外肾毒性评价。

流行性乙型脑炎SA_(14)-14-2弱毒株在狗胎肾细胞传代适应的研究

流行性乙型脑炎SA_(14)-14-2弱毒株经原代狗胎肾细胞连续传递4代以后,其病毒滴度稳定在7.5～8.0 log TCID_(50)/0.2ml。传代后的各代病毒(命名为 SA_(14)-14-2PDK-CD)对三周龄小鼠脑内无毒力、皮下无致病力、弱毒力稳定性和免疫原性等特性与原 SA_(14)-14-2 株相同。以该株病毒和原代狗肾细胞制备的活疫苗,经全面检定完全符合现行《乙型脑炎活疫苗规程》标准。

细胞凋亡在庆大霉素致MDCK细胞急性肾损伤中的作用

为了探讨细胞凋亡在急性肾损伤中的作用,试验以庆大霉素处理的MDCK细胞为急性肾损伤细胞模型,利用cck-8测定细胞活性,ELISA法检测肾脏损伤因子KIM-1和NGAL水平,Westernblot检测Bax、Bcl-2蛋白表达水平。结果表明：随着庆大霉素浓度的增加和时间的延长,与对照组相比,细胞活性呈显著或极显著下降（P〈0.05或P〈0.01）;细胞上清液中KIM-1含量随着庆大霉素浓度的增加呈显著或极显著上升趋势（P〈0.05或P〈0.01）,而NGAL含量随着庆大霉素浓度的增加呈先上升后下降的趋势,但无统计学意义;随着庆大霉素浓度的增加和时间的延长,Bax蛋白表达水平逐渐增加,Bcl-2蛋白表达水平逐渐降低。说明细胞凋亡在急性肾损伤中扮演着重要角色。

流感监测中流感病毒优势株在犬肾细胞系(MDCK细胞模型中竞争性复制的意义

目的通过流感病毒优势株在犬肾细胞系(Madin-Daby canine kidney cells,MDCK)细胞中竞争性复制,探讨季节性流感流行株感染、复制能力强弱对主导流行株的贡献。方法在对2011年至2012年上海市闵行区季节性流感监测中,监测到流感样病例775例,确诊流感病例119例。选取2012年1月至2月流感病例中分离的3株B型和3株A/H3N2亚型流感流行株,两两交叉配对成9组,共同感染MDCK,细胞培养上清液抽提核酸,mRT-PCR扩增特异性产物。结果有7组共感染组合中A/H3N2(210bp)电泳条带逐渐变强、B型条带(390bp)逐渐变弱至第3代完全消失,2组中A/H3N2与B的条带至第3代均明亮。结论流感病毒共感染竞争性复制结果与当时人群流感监测中优势株转换相符。该方法为探讨可能引起主导流行株在人群中变迁的原因提供了研究思路。

流行性乙型脑炎14-2株病毒在乳狗肾细胞上的适应性

流行性乙型脑炎14－2株弱病毒在乳狗肾细胞上连续传11代，1代的病毒滴度即达6．21LogPFU／ml，1代后各代病毒滴度无显著升高（6．18～6．40LogPFU／ml）。传代后的病毒对3周龄小鼠脑内无毒力，皮下无致病力，经乳鼠脑内传代后的脑内毒力为1．5～3．0LogLD5／0．03ml，与14－2原株的持世无显著差异。用乳狗肾细胞为基质制备的冻干活疫苗，经全面检定完全符合现行《乙型脑炎活疫苗规程》标准。

翡翠贻贝多糖抑制流感病毒在狗肾细胞中增殖的研究

目的研究翡翠贻贝多糖对流感病毒在狗肾细胞(MDCK)中增殖的抑制作用。方法采用血凝滴度测定研究翡翠贻贝多糖对MDCK细胞培养甲型流感病毒的抑制作用;通过联合用药试验研究翡翠贻贝多糖对利巴韦林抗流感病毒的协同效应。结果翡翠贻贝多糖能显著降低MDCK细胞培养流感病毒的血凝滴度;翡翠贻贝多糖与利巴韦林联合使用时,能显著抑制MDCK细胞培养流感病毒的增殖并具有相加效应。结论翡翠贻贝多糖能明显抑制MDCK细胞培养流感病毒的增殖,对利巴韦林抗流感病毒具有相加效应,具有开发成抗流感病毒生物制剂的前景。

甲型流感病毒H3N2诱导狗肾传代细胞凋亡的研究

目的探讨甲型流感病毒对体外培养的狗肾传代细胞系(MDCK)的凋亡诱导作用。方法用不同血凝单位的甲型流感病毒感染MDCK细胞,经HE染色、琼脂糖凝胶电泳以及流式细胞术等方法检测凋亡情况。结果甲型流感病毒感染MDCK后,在细胞形态上呈现凋亡特有变化;电泳出现典型梯状条带;AnnexinV染色流式细胞仪检测出在一定范围内,细胞凋亡率与病毒的浓度呈正相关。结论甲型流感病毒能够诱导体外培养的MDCK细胞凋亡,且在一定范围内,细胞凋亡率与病毒的浓度呈正相关。

Beagle狗肾细胞及用于制备乙脑活疫苗的研究

Ｂｅａｇｌｅ乳狗（５－１０日龄）肾块用热消化法制成细胞批放液氮保存，检定合格后做下列试验：（１）复苏培养长满单层后更换维持液，其细胞能维持４天以上，克服了常规消化培养细胞维持时间短（３６小时）的缺陷。（２）传代１４－２株病毒时，１代病毒的滴度即达６．０４－６．２４ＬｏｇＰＦＵ／ｍｌ，１代后的各代（至１１代）病毒滴度无明显提高。（３）该细胞接种１４－２株病毒时不产生明显的破坏性病变（ＣＰＥ），在收毒前采取冻溶１次比冻溶前的病毒滴度提高０．２７－０．５ＬｏｇＰＦＵ／ｍｌ。以ＢＤＫ细胞传１代的１４－２株病毒作生产毒种，收毒前冻溶１次等工艺法制备五批疫苗，全面检定结果均符合《乙脑活疫苗规程》的质量标准。其中病毒滴度为６．０９－６．２４ＬｏｇＰＦＵ／ｍｌ；免疫效价（ＩＤ５０＝ｍｌ）为１．９－４．０×１０－５，与相同滴度的原毒株１４－２ＰＨＫ苗对照无明显差异（ｔ＝０．９６８Ｐ＞０．０５），表明其免疫原性与原毒株相似。

基于狗肾小管上皮细胞的雷公藤甲素体外肾毒性研究

目的:观察雷公藤甲素对狗肾小管上皮细胞(MDCK细胞)的毒性作用,并初步探讨其对氧化应激的影响。方法:以马兜铃酸A为阳性对照,用0.5,5,50和500 nmol·L-1的雷公藤甲素与MDCK细胞共同孵育24 h后,MTT法检测细胞抑制率,乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测细胞膜损伤以及倒置显微镜观察雷公藤甲素对细胞形态的改变。用500 nmol·L-1雷公藤甲素分别与MDCK细胞作用30 min、1 h、2 h、4 h和6 h后,用2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)荧光探针检测细胞的活性氧自由基(ROS)水平。结果:与阴性对照组比较,雷公藤甲素组的细胞抑制率明显升高(P<0.01);LDH相对释放率明显增加(P<0.01)。雷公藤甲素处理组的细胞形态出现皱缩,呈现为球形,并有部分细胞脱落。雷公藤甲素与MDCK细胞作用30 min后ROS水平达到最高值,然后ROS逐渐减少(P<0.01)。结论:雷公藤甲素可诱导MDCK细胞的毒性作用,其毒性作用机制可能和氧化应激反应有关。

基于MDCK细胞模型的广防己体外肾毒性评价

目的采用MDCK细胞模型研究广防己的肾毒性,探讨MDCK细胞模型作为体外评价中药肾毒性方法的可行性。方法选择马兜铃和苦参作为阳性对照与阴性对照,通过MTT法测定细胞存活率,倒置显微镜观察细胞形态及乳酸脱氢酶(LDH)法检测细胞膜损伤,研究广防己对MDCK细胞的毒性作用。结果给药24 h后,各浓度的广防己组与阳性对照马兜铃组的细胞存活均被明显抑制,且倒置显微镜下可见细胞形态收缩变圆,部分细胞破裂脱落。通过比较乳酸脱氢酶的释放率,马兜铃与广防己对MDCK细胞膜的损伤明显高于阴性对照苦参组,统计学分析结果具有显著性差异(P<0.01)。结论 MDCK细胞模型可用于初步评价中药的体外肾毒性。

用狗肾细胞分离流感病毒出现细胞病变阳性血凝“阴性”的鉴定方法

用狗肾细胞分离流感病毒出现细胞病变阳性血凝“阴性”的鉴定方法０７１０００河北省卫生防疫站赵翠英，齐顺祥，高惠敏，李性善我们于１９８８年从日本引进狗肾细胞（ＭＤＣＫ），用于流感病毒分民但１９９互年以来，发现有些疑似流感标本接种ＭＤＣＫ细胞后，出现典型的...

流感病毒在Vero细胞系与MDCK细胞系增殖条件的比较

目的研究流感病毒H1N1及其他亚型在Vero细胞系和MDCK细胞系高效增殖的最适条件,比较两种细胞系对流感病毒的敏感性差异及影响敏感性差异的条件。方法在培养好的Vero细胞系与MDCK细胞系用不同的病毒感染复数(M.O.I)、胰酶浓度、病毒吸附时间、病毒维持液血清质量浓度等条件进行流感病毒在细胞上的增殖。结果在M.O.I为0.01接种流感病毒,吸附时间为1 h,胰酶质量浓度2μg/mL,血清质量浓度为8%时,流感病毒血凝素在MDCK细胞系可获得较高的滴度。结论 MDCK细胞系是适于流感病毒培养的细胞,它作为生产新型流感病毒疫苗的主要细胞基质需要进一步的研究。

基于CRISPR/Cas9系统的MDCK细胞IFN-β1编码序列的敲除

为了建立高品质的犬肾(MDCK)单克隆细胞系,使用CRISPR/Cas9技术实现MDCK细胞IFN-β1基因的敲除,构建细胞培养禽流感病毒(AIV)增殖体系。首先,根据CRISPR/Cas9系统的技术要求构建了Cas9表达载体和sgRNA载体;然后,用3种载体共转染MDCK细胞,通过GFP阳性特征分选单细胞克隆,单细胞克隆培养在96孔板中。通过PCR扩增和对IFN-β1靶序列进行测序,确定了阳性MDCK单细胞克隆中IFN-β1的敲除。结果成功构建了具有IFN-β1敲除的MDCK单细胞克隆细胞系,与原始细胞相比,该细胞系的病毒增殖能力提高。

MDCK细胞宿主蛋白含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的建立检测犬肾细胞(madin-darby canine kidney, MDCK)宿主细胞蛋白(host cell protein, HCP)含量的双抗体夹心ELISA。方法从MDCK细胞中提取细胞总蛋白,免疫新西兰兔制备兔抗MDCK细胞蛋白多克隆抗体,抗体经辛酸-硫酸铵沉淀和Protein A层析纯化后,采用SDS-PAGE分析抗体纯度,Western blot检测抗体特异性。用纯化的多克隆抗体作为包被抗体,并采用改良过碘酸钠标记法制备酶标抗体,建立ELISA并确定包被抗体浓度和辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体稀释度等最适条件。确定该方法较佳的线性范围及检测限,并对该法特异性、准确度、精密性和重复性进行验证。最后,用该方法分别对接种流感病毒的MDCK细胞上清收获液和纯化样品进行MDCK细胞蛋白含量检测,初步验证其在纯化工艺开发中的适用性。结果通过免疫新西兰兔制备了高滴度的兔抗MDCK细胞蛋白多克隆抗体血清,滴度可达1∶8 000。纯化后的兔抗MDCK细胞蛋白多克隆抗体纯度>90%,并可与MDCK细胞蛋白特异性结合。建立的双抗体夹心ELISA的理想包被抗体质量浓度为10μg/mL,酶标抗体的工作浓度为1∶500稀释。该方法的线性范围为50~2 500 ng/mL,检测限为50 ng/mL;该方法对Vero细胞、293T细胞和Mrc-5细胞等其他细胞HCP无交叉反应,特异性良好;不同浓度的MDCK细胞HCP回收率在98.5%~111.9%之间,变异系数均<10%。接种流感病毒的MDCK细胞培养上清经多步纯化后MDCK细胞蛋白质量浓度逐渐降低至<900 ng/mL,纯化工艺可有效去除MDCK细胞蛋白残留。结论建立双抗体夹心ELISA检测MDCK细胞残余HCP含量的方法,可用于基于MDCK细胞培养的流感疫苗下游工艺开发中宿主细胞残留HCP含量监测。

犬脂肪间充质干细胞及其外泌体修复庆大霉素致犬肾小管上皮细胞损伤

背景:犬肾脏损伤的特点是肾小管上皮细胞凋亡坏死。最近研究表明间充质干细胞及其外泌体在人、大鼠、小鼠肾损伤治疗中显示出良好的效果,但对犬的研究甚少。目的:探讨犬脂肪间充质干细胞及其外泌体对庆大霉素致犬肾小管上皮细胞损伤的影响。方法:采用5 mmol/L硫酸庆大霉素处理犬肾小管上皮细胞,随后分别将犬脂肪间充质干细胞及其条件培养基和外泌体与受损犬肾小管上皮细胞共培养。在24 h及48 h后采用CCK-8法测定各组细胞增殖活力,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,最后通过Q-PCR法检测PCNA、Bcl-2和Bax基因的表达。结果与结论:犬脂肪间充质干细胞及其条件培养基和外泌体均可显著促进受损犬肾小管上皮细胞增殖以及减少细胞凋亡(P<0.05),其中犬脂肪间充质干细胞外泌体的效果最好,可显著提高受损犬肾小管上皮细胞PCNA、Bcl-2基因的表达(P<0.05),对庆大霉素诱导的犬肾小管上皮细胞损伤发挥修复作用。

干扰素-α2a对流感病毒感染的MDCK作用的研究

目的探讨干扰素-α2a对甲型流感病毒感染的狗肾传代细胞系(MDCK)的作用。方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察不同浓度(0.01、0.1、1、10、100U/ml)IFN-α2a在H3N2病毒感染MDCK0h、1h和4h后对细胞活性的影响。结果不同浓度的IFN-α2a能抑制正常生长及病毒感染1h、4h后的MDCK的增殖,但能促进病毒感染0h后的MDCK的生长,其中1.0U/ml组与对照组相比有显著差异(P<0.01)。结论IFN-α2a除了可抑制MDCK生长之外,还能促进H3N2感染初期细胞的增殖。

基于MDCK细胞单层的药物早期肾毒性检测初探

目的:初步探索基于犬肾小管上皮细胞(Madin-Darby canine kidney,MDCK)细胞单层的药物早期肾毒性检测方法。方法:将MDCK细胞培养于微孔滤膜上,待其形成完整的细胞单层。通过MTT试验分别选择对MDCK细胞没有明显抑制及具有明显抑制的不同质量浓度作用于细胞单层,24 h后进行荧光素钠透过性试验以及细胞单层两侧分泌的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase,γ-GT)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性检测,同时用扫描电镜观察细胞单层结构。结果:选择3.13,6.25,12.5 mg.L-13种质量浓度的马兜铃酸(aristolochic acid,AA)进行毒性检测,其对MDCK细胞生长的抑制率分别为-0.93%,0.93%和24.30%。AA 3.13 mg.L-1没有对细胞单层的完整性造成破坏,荧光素钠不能透过细胞单层,而AA 6.25,12.5 mg.L-1在与细胞作用30 min后,能明显增加荧光素钠的透过(P<0.05,P<0.1),其中12.5 mg.L-1造成的荧光素钠透过率增加更多。各组细胞单层两侧ALP,γ-GT的分泌没有明显改变,但12.5 mg.L-1能使LDH的分泌显著增加(P<0.05)。扫描电镜观察显示,AA 6.25,12.5 mg.L-1组细胞单层结构被破坏,表面出现大量小球状物体,细胞单层破损而变得不完整,有不同程度的微孔滤膜露出。结论:基于MDCK细胞单层,在AA对细胞生长没有明显抑制的浓度(6.25 mg.L-1),可以检测到药物对细胞的毒性损伤,提示建立在微孔滤膜上的MDCK细胞单层体系可以用于药物肾毒性的早期检测。